陳希，穆祥，許劍琴

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.北京農(nóng)學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206；3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100094)

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LLO對大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞分泌NO和ET-1的影響

陳希1，穆祥2*，許劍琴3*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.北京農(nóng)學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206；3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100094)

為探討李斯特菌溶血素(LLO)導致大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞(RIMVECs)損傷的作用機制，將體外培養(yǎng)的RIMVECs分為對照組和LLO組，觀察細胞形態(tài)變化，測定細胞生長情況，并檢測細胞培養(yǎng)上清液中NO、ET-1濃度變化。結(jié)果表明：LLO組RIMVECs的細胞間隙變大，有大量細胞碎片漂??；當LLO濃度達到50ng/mL以上時，測得細胞增殖(OD值)均呈極顯著下降(P<0.01)；12 h內(nèi)，NO、ET-1分泌量高于正常水平。試驗表明，LLO引起RIMVECs細胞因子NO、ET-1分泌量升高，導致細胞微環(huán)境紊亂，是LLO導致腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞損傷的機制之一。

大鼠腸黏膜；微血管內(nèi)皮細胞；LLO；NO；ET-1

李斯特菌溶血素(Listeriolysin O，LLO)是產(chǎn)單核細胞李斯特菌(L.monocytogenes，LM)的最主要毒力因子[1]。LM通過分泌LLO作用于內(nèi)皮細胞等靶細胞，導致細胞因子分泌紊亂及細胞膜穿孔，進而侵入細胞內(nèi)增殖并誘發(fā)機體產(chǎn)生病理癥狀[2-3]。LM在自然感染時，最主要的特征是入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胎盤。因此，LLO可引起構(gòu)成血腦屏障和胎盤屏障的微血管內(nèi)皮細胞損傷。作為一種重要的食源性細菌，LLO是否首先作用于腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞，并引起細胞損傷尚未見報道。由于不同組織器官的微血管內(nèi)皮細胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能上存在異質(zhì)性，本研究以大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞(Rat Intestinal Mucosal Microvascular Endothelial Cells,RIMVECs)為研究對象，旨在了解LLO對腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞的損傷機制。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；D-Hank’s干粉，Sigma公司；胰蛋白酶，Gibco公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，F(xiàn)BS,PAA公司；L-谷氨酰胺，Sigma公司；兔抗人第Ⅷ因子相關抗原抗血清，中杉金橋生物技術(shù)公司；羊抗兔IgG-FITC，中杉金橋生物技術(shù)公司；NO測試試劑盒，晶美生物工程有限公司；大鼠ET-1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，美國R&B公司。Wistar大鼠，1日齡，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所動物中心提供，符合國家實驗動物標準。

1.2 LLO的分離純化 參照文獻方法[4]，將培養(yǎng)的LM菌液離心通過0.22 μm過濾，硫酸銨沉淀、透析、濃縮處理后，通過SephadexG-100分子篩層析，洗脫回收。經(jīng)SDS-PAGE鑒定LLO為單條帶型，達電泳級純度，分子量為60000 Da。

1.3 RIMVECs的分離培養(yǎng) 參考文獻方法[5]，選用1日齡Wistar大鼠，用外科手術(shù)方法獲得空腸，D-Hank’s液沖洗后，仔細撕除腸管漿膜層附著的腸系膜，暴露出腸黏膜微血管豐富組織。經(jīng)過胰酶消化，120～150 μm細胞篩過濾，與完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基、20%胎牛血清、2% L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、10 μg/mL鏈霉素)混合，接種于細胞培養(yǎng)板，置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。應用差速貼壁、胰酶消化和機械刮除法對培養(yǎng)細胞除雜純化，待純化細胞生長至80%融合時即可進行傳代。倒置顯微鏡下，可見單層細胞呈典型的鋪路石狀相嵌排列。免疫熒光法檢測內(nèi)皮細胞第Ⅷ因子相關抗原抗陽性(圖1)。

圖1 第Ⅷ因子相關抗原抗鑒定陽性

1.4 細胞處理 試驗使用第3代細胞。將融合生長的內(nèi)皮細胞，以0.25%胰蛋白酶消化，細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板，細胞密度5×108/L，每孔加150 μL完全培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞融合成單層細胞即行試驗。

1.4.1 不同濃度LLO對RIMVECs形態(tài)及增殖的影響觀察 將培養(yǎng)板中已生長融合的RIMVECs分為空白組(LLO為0 μg/mL)和LLO處理組，按LLO終濃度分為5 μg/mL、1 μg/mL、500 ng/mL、50 ng/mL和5 ng/mL，每組設重復孔6個，空白組加維持培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h后鏡下觀察細胞形態(tài)及不同濃度LLO對細胞增殖的影響。

1.4.2 LLO對RIMVECs分泌NO、ET-1的影響觀察根據(jù)細胞增殖測定結(jié)果，將培養(yǎng)板中已生長融合的RIMECs分為空白組(LLO為0 g/mL)和LLO處理組(50 ng/mL)，每個組分5個不同時間段的亞組。每個亞組設5 個重復孔?？瞻捉M加維持培養(yǎng)基。分別于培養(yǎng)1、3、6、9、12 h 后收集上清液，3000 r/min離心5 min后，取上清于- 20 ℃條件下保存待測。

1.5 細胞增殖的測定 參照文獻方法[6]，采用MTT法測定細胞增殖情況，即將96孔細胞培養(yǎng)板置入CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃、5%CO2靜置培養(yǎng)24 h。吸凈細胞上清液后，在各孔細胞中加入5 mg/mL的MTT 30 (L及150 (L的DMEM維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，輕輕吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃孵育30 min后，待細胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，于酶標儀570 nm波長處測定各組OD值。

1.6 細胞培養(yǎng)上清液內(nèi)NO及ET-1濃度的測定參照文獻方法[7]，采用硝酸還原酶法測定NO濃度，雙夾心ELISA法測定ET-1濃度，具體參照試劑盒說明進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度LLO對RIMVECs形態(tài)及增殖的影響 細胞培養(yǎng)12 h后，鏡下觀察LLO各濃度組和空白組細胞，對比發(fā)現(xiàn)，LLO處理組(5 μg/mL、1 μg/mL)可見大量漂浮細胞碎片，基本沒有殘存貼壁細胞；LLO處理組(500 ng/mL、50 ng/mL)可見不同程度的細胞間隙變大，細胞碎片漂??；LLO處理組5ng/mL和空白組細胞形態(tài)良好(圖2)。

從左到右LLO濃度依次為：1 μg/mL、500 ng/mL、50 ng/mL和0 ng/mL圖2 RIMVECs在不同濃度LLO作用下的形態(tài)學觀察(12 h)

LLO處理組(除5 ng/mL以外)，細胞增殖(OD值)均極顯著下降(P<0.01)低于對照組，且50ng/mL的LLO濃度即可抑制細胞增殖或?qū)毎斐蓳p傷(圖3)。因此確定以50ng/mL的LLO濃度作為后續(xù)試驗毒素作用濃度。

與空白組相比，**表示P<0.01圖3 不同濃度LLO對RIMVECs增殖的影響

2.2LLO對RIMVECs分泌NO和ET-1的影響 由表1可知，12h內(nèi)，各時間段LLO組NO分泌量均高于正常水平；細胞ET-1的分泌量如表2所示：各時間段LLO組ET-1分泌量均高于空白組。結(jié)果表明：在12h內(nèi)，50ng/mL的LLO可以引起RIMVECs分泌NO和ET-1升高，12h達到最高值。

表1 RIMVECs細胞培養(yǎng)上清液NO濃度的變化 μmol/L

表2 RIMVECs細胞培養(yǎng)上清液ET-1濃度的變化 pg/mL

2.3 LLO對RIMVECs細胞微環(huán)境NO、ET-1平衡關系的影響 由圖4可知，空白組RIMVECs的NO/ET比值維持在10左右，而LLO組比值隨時間逐漸下降，說明LLO可以破壞RIMVECs分泌NO、ET-1的平衡，導致細胞微環(huán)境紊亂。

圖4 不同時間段測得兩組細胞NO/ET-1的比值

3 討論與小結(jié)

3.1 LLO對RIMVECs形態(tài)及增殖的影響 血管內(nèi)皮細胞受損是創(chuàng)傷、感染、休克、腫瘤、全身性炎癥反應綜合征以及多器官功能障礙發(fā)生、發(fā)展的病理學基礎[8-10]。腸黏膜作為機體天然屏障部位，必然在腸道感染、細菌移位中起到關鍵作用，位于腸黏膜上的RIMVECs不僅是被動的靶細胞，更是一種效應細胞[11]。據(jù)文獻報道[6]，LM通過分泌毒力因子LLO，可侵入多種宿主細胞，包括上皮細胞、肝實質(zhì)細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、甚至巨噬細胞。在自然感染時，最主要的特征是入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胎盤。因此，循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的LM必須通過與血管內(nèi)皮細胞作用穿過血腦屏障和胎盤屏障。同時，微血管內(nèi)皮細胞沿血液流動的方向，不僅構(gòu)成了血腦屏障，也構(gòu)成了肝、腎等其它組織器官內(nèi)血液與組織間的主要屏障。因此，LM引起各組織器官的損傷首先要通過微血管內(nèi)皮細胞并與其發(fā)生作用。目前，國外已有報道表示通過體外細胞試驗(人腦微血管內(nèi)皮細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞)證實了LM對血管內(nèi)皮細胞的刺激與損傷[7-8]。本研究表明，經(jīng)不同濃度的LLO處理后，RIMVECs的形態(tài)損害程度隨著LLO濃度的增加而加劇，細胞間隙逐漸增大，證明該內(nèi)皮細胞是LLO作用的靶細胞。LM感染后可通過釋放毒力因子LLO導致腸黏膜上的RIMVECs損傷，進而突破腸黏膜屏障進入血液。

3.2 LLO對RIMVECs分泌NO、ET-1及NO/ET比值的影響 NO是一種由血管內(nèi)皮細胞分泌的內(nèi)源性血管舒張因子[12]，作為一種重要的信使分子對于動、靜脈和微血管均有擴張作用，能夠抑制缺氧引起的血管收縮，并具有神經(jīng)傳遞以及殺滅微生物和腫瘤細胞等多種生物學功能[11]。而ET-1是目前已知的最強大的血管收縮劑，其作用正好同NO相頡頏。研究表明，NO的降低導致血管舒張水平降低，高濃度ET強烈收縮動、靜脈，尤以冠狀動脈、腎、腸系膜、腦及皮膚等微循環(huán)血管，加重微循環(huán)障礙及內(nèi)皮細胞損害，惡性循環(huán)致組織缺氧，細胞能量耗竭進一步加重，最終導致多器官功能衰竭的發(fā)生[13]。本研究表明，LLO可導致RIMVECs分泌NO、ET-1增多，NO/ET-1比值逐步下降，NO/ET-1平衡破壞，引起微循環(huán)障礙。同時，NO和ET-1的平衡關系被打破，微血管的緊張度發(fā)生異常改變，這可能是LM感染機體引起腸道組織損傷及機體多種組織器官病變原因之一。

本研究通過檢測LLO對體外培養(yǎng)RIMVECs的細胞形態(tài)、分泌NO、ET-1及NO/ET-1比值變化，確定LLO可直接損傷RIMVECs，并引起NO濃度升高以及ET-1的降低，說明LLO引起的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞功能障礙在李斯特菌病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。關于LLO引起NO、ET-1以及其他細胞因子紊亂的分子作用機制還需進一步深入研究。

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(編輯：李文平)

Effects of Lipopolysaccharide on Secretion of NO and ET-1 of Rat Intestinal Mucosa Microvascular Endothelial Cellsinvitro

CHEN Xi1,MU Xiang2*,XU Jian-qin3*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China；2.BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China;3.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)

The purpose of this study was to research on the functional mechanism of Listeriolysin O (LLO) damaging intestinal mucosa microvascular endothelial cells.Rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells (RIMVECs) were in culture divided into blank control group and LLO group.Cells were observed under microscope and assessed proliferation by MTT assay.The Changes of NO and ET-1 level in cell culture supernatants were measured.Compared with blank group,the intercellular space was enlarged in LLO group.Cell debris floated in culture medium.When the concentration of LLO was up to 50 ng/mL,proliferation of RIMVECs was very significantly decreased.The production of NO and ET-1 were enhanced for 12h.The functional mechanism of LLO damaging intestinal mucosa microvascular endothelial cells may be that LLO leads to the rise in the secretion of NO and ET-1.

intestinal mucosa；microvascular endothelial cells；LLO； NO；ET-1

北京市自然科學基金A類重點項目(6061001)；北京市教委人才強教“學術(shù)創(chuàng)新團隊”中藥方劑研究(5090245)

陳希，博士，從事中獸藥相關研究。

穆祥，muxiang1109@sina.cn；許劍琴，E-mail: jianqinxucau@126.com

2015-10-28

A

1002-1280 (2015) 12-0009-05

S852.44