賈博巖,趙立峰,高鐸,2,孔令聰,劉樹明,王春鳳,馬紅霞, 3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,長春 130118; 2.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心,遼寧 110000 ; 3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室,長春 130118)

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牛支原體氟喹諾酮類藥物耐藥靶位突變分析

賈博巖1,趙立峰1,高鐸1,2,孔令聰1,劉樹明1,王春鳳1,馬紅霞1, 3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,長春 130118; 2.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心,遼寧 110000 ; 3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室,長春 130118)

為探討牛支原體氟喹諾酮類藥物耐藥靶位的突變情況，對分離自我國多個省份的牛支原體進行氟喹諾酮類藥物耐藥性檢測和耐藥株篩選，通過對臨床分離敏感株、耐藥株及體外誘導(dǎo)高度耐藥株的氟喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)(QRDR)進行測序分析，發(fā)現(xiàn)分離菌株中有19%(6/32株)對氟喹諾酮類藥物耐藥，其QRDR中均存在gyrA(Ser83Phe)或parC(Ser80Ile)的氨基酸突變；但在體外誘導(dǎo)的高度耐藥株中QRDR突變類型則以gyrA(Ser83Phe/Tyr或Glu87Lys)和parC(Ser80Ile或Asp84Asn/Tyr)的氨基酸發(fā)生突變?yōu)橹?，以上靶位突變在介?dǎo)牛支原體對氟喹諾酮類藥物耐藥水平方面是否起著決定性作用，還有待進一步證明。

牛支原體;氟喹諾酮類藥物;靶位突變

牛支原體(Mycoplasmabovis,M.bovis)是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病的(Bovine respiratory disease,BRD)主要病原之一[1]，該病原引發(fā)的疾病主要采用大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類抗生素進行治療[2]。但隨著抗生素在獸醫(yī)臨床上的廣泛使用，導(dǎo)致M.bovis對上述藥物逐漸產(chǎn)生了耐藥性。近年來，牛支原體病主要治療藥物的耐藥性所引起的抗感染失敗給我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了較嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[3]。

氟喹諾酮類藥物是80年代興起的一類廣譜抗菌藥物，由于其在臨床應(yīng)用時間相對較短，臨床分離菌對其相對敏感，日益受到獸醫(yī)臨床工作者的青睞。國外，Sato T等[4]對從日本奶牛廠分離的M.bovis進行氟喹諾酮類藥物耐藥性檢測及耐藥機制的研究；國內(nèi)，張利等[5]對從重慶分離的M.bovis進行耐藥情況的監(jiān)測，但尚未有相關(guān)耐藥QRDR靶位研究的報道。為此，本文以從我國臨床分離的M.bovis為研究對象，在對其進行氟喹諾酮類藥物耐藥性檢測的基礎(chǔ)上，對其QRDR靶位突變進行分析，為闡明我國臨床分離M.bovis對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制提供佐證。

1 材料與方法

1.1 菌種 32株M.bovis分離自我國江蘇、貴州、湖南、廣西、內(nèi)蒙、吉林等9個省份，并由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院獸醫(yī)藥理與毒理實驗室保存。

1.2 主要試劑及藥品 PPLO肉湯培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DMEM培養(yǎng)基,Invitrogen生命科技有限公司；酵母粉、瓊脂等,北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；ExTaqTMDNA聚合酶、dNTPs、pMD18-T載體試劑盒、DL 1000TMDNA Marker,大連TakaRa有限公司；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、丙酮酸鈉,生工生物工程(上海)股份有限公司；環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星,中國食品藥品檢定研究院。

1.3 藥物敏感性試驗 采用改良微量稀釋法檢測臨床分離的M.bovis對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星三種氟喹諾酮類藥物的最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)，并以大腸桿菌ATCC?25922和M.bovis標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45作為質(zhì)控株，判定結(jié)果參照BRD其他病原的CLSI標(biāo)準(zhǔn)，MIC≥4 μg/mL判定為耐藥[6-7]。

1.4 體外高度耐藥株的誘導(dǎo) 將來自臨床分離的對氟喹諾酮類藥物敏感的5株M.bovis分別接種于含有1/8 MIC的環(huán)丙沙星、恩諾沙星和諾氟沙星的PPLO(含10%胎馬血清)液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)2～3 d后觀察結(jié)果，若培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)槌吻宓狞S色，再將其接種于含有1/4MIC藥物的液體培養(yǎng)基中。以上述藥物濃度的2倍依次遞增，直至其藥物濃度達到64 μg/mL及以上。誘導(dǎo)中若M.bovis在某藥物濃度下未生長或生長狀態(tài)欠佳，則降低藥物濃度重新誘導(dǎo)[8-10]。

1.5 穩(wěn)定耐藥試驗 將經(jīng)體外誘導(dǎo)獲得的對氟喹諾酮類藥物高度耐藥的M.bovis接種于無藥物壓力的培養(yǎng)基中傳代5次，再應(yīng)用改良微量稀釋法測定其誘導(dǎo)藥物的MIC值，篩選耐藥性穩(wěn)定的M.bovis[8-10]。

1.6 交叉耐藥試驗 采用改良微量稀釋法檢測體外誘導(dǎo)的對氟喹諾酮類藥物高度耐藥的M.bovis對3種氟喹諾酮類藥物的交叉耐藥性[8-10]。

1.7 QRDR靶位突變檢測 提取氟喹諾酮敏感株、耐藥株及體外誘導(dǎo)株的基因組，參照文獻方法[11]合成gyrA、gyrB、parC和parE的 QRDR基因引物，進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min，(95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán))，72 ℃總延伸10 min，10 ℃保存。將PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后進行T-A克隆，篩選出重組陽性質(zhì)粒，并將含有重組陽性質(zhì)粒的大腸桿菌菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，采用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行對比分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性試驗結(jié)果 臨床分離的M.bovis對三種氟喹諾酮類藥物MIC值的檢測結(jié)果表明，有6株(19%)M.bovis對氟喹諾酮類藥物耐藥(MIC為4或8 μg/mL)，其他菌株均對氟喹諾酮類藥物相對敏感，MIC值測定結(jié)果見表1。

表1 32株M.bovis對三種氟喹諾酮類藥物MIC測定結(jié)果(μg/mL)

2.2 體外耐藥株篩選及交叉耐藥性檢測 將經(jīng)體外誘導(dǎo)獲得的對一種氟喹諾酮類藥物高度耐藥的M.bovis進行無藥物壓力培養(yǎng)，共篩選到15株高度耐藥M.bovis，且其它兩種氟喹諾酮類藥物均存在交叉耐藥現(xiàn)象，結(jié)果見表2。

表2 體外誘導(dǎo)株穩(wěn)定耐藥性及交叉耐藥性檢測結(jié)果 (μg/mL)

2.3 QRDR突變分析 對臨床分離的M.bovis氟喹諾酮類藥物敏感株、耐藥株及體外誘導(dǎo)獲得的高度耐藥株進行氟喹諾酮類藥物耐藥靶位(gyrA、gyrB、parC、parE)突變分析，結(jié)果表明，臨床分離的氟喹諾酮類藥物敏感株在parC的QRDR中均存在(GAC84GAT)的無意義堿基的突變，即未導(dǎo)致其編碼的氨基酸發(fā)生突變；臨床分離的6株對氟喹諾酮類藥物耐藥的M.bovis在gyrA或parC的QRDR中存在(TCT83TTT)或(AGT80ATT)的堿基突變，進而導(dǎo)致其所對應(yīng)的(Ser83Phe)或(Ser80Ile)的氨基酸發(fā)生突變，且上述耐藥株的耐藥水平相對較低；體外誘導(dǎo)對氟喹諾酮類藥物高度耐藥的15株M.bovis在gyrA和parC的QRDR中存在[(TCT83TTT/TAT)或 (GAA87AAA)]和 [(AGT80ATT)或(GAT84AAT/TAT) ]的堿基突變，進而導(dǎo)致其所對應(yīng)的(Ser83Phe/Tyr或Glu87Lys)和(Ser80Ile或Asp84Asn/Tyr)的氨基酸發(fā)生突變，且上述體外誘導(dǎo)的M.bovis的耐藥水平相對較高(表3-表4)。

表3 臨床分離的32株M.bovis的QRDR突變情況

S：Ser； F：Phe；I：Ile；-：未發(fā)生氨基酸置換；Ⅰ：在QRDR中有一個氨基酸發(fā)生置換；Ⅰ-1、Ⅰ-2：在QRDR中均有一個氨基酸位點發(fā)生突變，兩者氨基酸的突變位點不同

表4 體外誘導(dǎo)的對氟喹諾酮類藥物高度耐藥的15株M.bovis 的QRDR突變情況

S， F， I，- ，Ⅰ：見表3標(biāo)注； E：Glu； D：Asp； K：Lys； N：Asn； Y：Tyr ； CIP：ciprofloxacin 環(huán)丙沙星； ENR:enrofloxacin 恩諾沙星；NOR：norfloxacin 諾氟沙星；Ⅱ，Ⅲ分別代表：在QRDR中有2個，3個氨基酸發(fā)生置換；Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5分別代表：在QRDR中均有兩個氨基酸位點發(fā)生突變，五者氨基酸的突變位點不同

3 討論與小結(jié)

試驗以從我國東北、華中、華南、華東、西南、西北等地區(qū)的9個省份所分離的M.bovis為基礎(chǔ)，進一步對其氟喹諾酮類藥物的敏感性進行檢測，結(jié)果表明，我國臨床分離的M.bovis均對氟喹諾酮類藥物較為敏感，但從內(nèi)蒙、吉林、遼寧三省分離的部分M.bovis已對氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生了耐藥性(其MIC為4或8μg/mL)，分離的耐藥菌株占此次臨床分離M.bovis的19%。此結(jié)果與Lysnyansky I等和Sato T等的報道基本一致，此兩組研究人員在以色列和日本檢測到的M.bovis耐藥率分別為有26%和12%，且MIC值均較低(MIC≤16μg/mL)[4,11]。試驗通過體外誘導(dǎo)證實若M.bovis持續(xù)處于此類藥物的藥物壓力下則容易出現(xiàn)氟喹諾酮類藥物高度耐藥株，故建議獸醫(yī)臨床應(yīng)合理、科學(xué)、正確的使用氟喹諾酮類藥物，控制其耐藥性的產(chǎn)生和蔓延。

本試驗進一步對臨床分離的M.bovis氟喹諾酮類藥物敏感株、耐藥株及體外誘導(dǎo)高度耐藥株進行了QRDR靶位突變分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臨床分離的氟喹諾酮類藥物敏感株在QRDR未發(fā)生氨基酸突變；臨床分離的對氟喹諾酮類藥物低度耐藥的6株M.bovis在gyrA或parC的 QRDR中存在單一氨基酸突變點，即Ⅰ型突變；體外誘導(dǎo)的對氟喹諾酮類藥物高度耐藥的15株M.bovis在gyrA和parC 的QRDR存在兩個或三個氨基酸突變點，其共有6種突變類型(Ⅱ-1-5型、Ⅲ型),并以兩個氨基酸突變點的Ⅱ-1型[gyrA(Ser83Phe)和parC(Ser80Ile)]和Ⅱ-3型[gyrA(Glu87Lys)和parC(Ser80Ile)]較為普遍。據(jù)此推測，當(dāng)gyrA或parC的QRDR發(fā)生(Ser83Phe)或(Ser80Ile)單一氨基酸突變可介導(dǎo)M.bovis對氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性，且當(dāng)gyrA和parC的QRDR同時發(fā)生(Ser83Phe/Tyr或Glu87Lys)和(Ser80Ile或Asp84Asn/Tyr)氨基酸突變可能介導(dǎo)M.bovis對氟喹諾酮類藥物高度耐藥。此結(jié)論與Sato T等的報道有所不同，該研究團隊發(fā)現(xiàn)臨床分離的部分M.bovis氟喹諾酮類藥物敏感株在gyrA的QRDR中檢測到Ser83Phe的氨基酸突變，且推斷parC的氨基酸突變是導(dǎo)致M.bovis對氟喹諾酮類藥物耐藥的主要原因[4]，但本試驗臨床分離的M.bovis氟喹諾酮類藥物敏感株在gyrA的QRDR中未檢測到氨基酸的突變?？傊?，M.bovis是否還存在其他耐藥機制仍有待于進一步研究。

[1] 高鐸,孔令聰,王梓,等.牛支原體的分離鑒定及其體外藥物敏感性分析[J].中國獸藥雜志,2014,48(3): 66-68.

[2] 吳儀謀,葉元康.支原體學(xué)[M].人民衛(wèi)生出版社,2008: 16-25.

[3] 孔令聰,張春艷,高云航,等.牛支原體耐藥性研究進展[J].中國獸藥雜志,2013,47(9): 63-66.

[4] Sato T,Okubo T,Usui M,etal.Amino acid substitutions in GyrA and ParC are associated with fluoroquinolone resistance inMycoplasmabovisisolates from Japanese dairy calves[J].Journal of Veterinary Medical Science,2013,75(8): 1063-1065.

[5] 張利,李玉平,黎曉敏.牛支原體藥物敏感性試驗[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2012,33: 110-113.

[6] Clinical and Laboratory Standards Insitute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: approved standard[M].CLSI document,2012: M100-S22.

[7] Soehnlen M K,Kunze M E,Karunathilake K E,etal.Invitroantimicrobial inhibition ofMycoplasmabovisisolates submitted to the pennsylvania animal diagnostic laboratory using flow cytometry and a broth microdilution method[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,2011,23(3): 547-551.

[8] 孔令聰.牛源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及對喹諾酮類抗生素耐藥機制研究[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[9] 葉萍,鄧超干,王輝,等.體外誘導(dǎo)人型支原體對氟喹諾酮類藥物耐藥的實驗研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2009,38(6): 659-660.

[10]劉軼秋,吳聰明,沈建忠,等.3種禽源支原體替米考星耐藥株的體外誘導(dǎo)及23S rRNA基因V域堿基突變分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2011,42(7): 981-987.

[11]Lysnyansky I,Mikula I,Gerchman I,etal.Rapid detection of a point mutation in theparC gene associated with decreased susceptibility to fluoroquinolones inMycoplasmabovis[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(11): 4911-4914.

(編輯：陳希)

Quinolones Resistance Targeted Mutation Analysis ofMycoplasmabovis

JIA Bo-yan1,ZHAO Li-feng1,GAO Duo1,2,KONG Ling-cong1,LIU Shu-ming1,WANG Chun-feng1,MA Hong-xia1,3*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.LiaoningProvinceQualityInspectionandTestcenterforVeterinaryDrugfeedandAnimalproduct,Liaoning110000,China; 3.AnimalProduction&ProductQualityandSecurity,MinistryofEducation,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

In order to discuss the quinolones resistance targeted mutation analysis ofMycoplasmabovis.In this study,Mycoplasmabovisisolated from several provinces were tested on quinolone resistance and quinolone resistant strains were screened.The quinolone resistance determining region(QRDR) of clinical isolates sensitive ,resistant strains and resistant strains induced in vitro were sequenced.The results showed that 19%isolates strains (6/32) were resistant to quinolones,and it was found that the resistant strains possess Ser83Phe in gyrA or ser80Ile In parC.But it found that the QRDR mutation types based ongyrA(Ser83Phe/Tyr or Glu87Lys) and parC(Ser80Ile or Asp84Asn/Tyr)in laboratory -derived resistantMycoplasmabovis.The above targeted mutation either whether paly an important role in mediating the quinolone resistance level ofMycoplasmaboviswill remains to be further proved.

Mycoplasmabovis; quinolone; targeted mutation

國家自然科學(xué)基金項目(31272611); 吉林省科技發(fā)展計劃項目任務(wù)書(20150101109JC)

賈博巖，碩士研究生，從事動物藥理和毒理學(xué)方面研究；趙立峰，高級獸醫(yī)師，從事獸醫(yī)臨床方面研究，與賈博巖為并列第一作者。

馬紅霞。E-mail:hongxia0731001@163.com

2015-08-11

A

1002-1280 (2015) 12-0001-05

S852.62