劉偉卿 周 靜

藥物生物轉(zhuǎn)化是指藥物在體內(nèi)經(jīng)歷的化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化過程。大部分藥物經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后藥理活性降低甚至消失，最終隨尿和糞便排除體外，但也有一些藥物通過生物轉(zhuǎn)化后藥理活性增強(qiáng)或毒性增加。因此，藥物生物轉(zhuǎn)化不僅影響藥物作用的強(qiáng)弱和持續(xù)時間的長短，而且還會影響藥物治療的安全性，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。對于創(chuàng)新藥物，需了解其在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化情況。通過藥物生物轉(zhuǎn)化研究，發(fā)現(xiàn)并確定產(chǎn)生藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，掌握藥物生物轉(zhuǎn)化規(guī)律，對于設(shè)計(jì)更合理的給藥途徑、給藥方法、給藥劑量，以及對制劑處方的設(shè)計(jì)、工藝改革和臨床都具有指導(dǎo)意義。

藥物生物轉(zhuǎn)化的主要部位在肝臟，肝外生物轉(zhuǎn)化場所有：消化道、肺、皮膚、腦、鼻黏膜、腎臟等，也可被腸內(nèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)化。肝臟外器官的生物轉(zhuǎn)化活性比肝臟要低得多，所以至今為止對藥物生物轉(zhuǎn)化的研究大多以肝臟為主。

1 傳統(tǒng)體內(nèi)方法

傳統(tǒng)體內(nèi)方法是指在動物或人服藥過后，經(jīng)過一段時間后收集血液、尿液和膽汁等生物樣品（動物還可以獲得組織器官等實(shí)驗(yàn)樣本）。然后用溶劑提取或采取柱色譜或薄層制備，有的經(jīng)HPLC制備得到較純品，再對原藥及生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行紫外、紅外、質(zhì)譜、磁共振等光譜分析，推斷生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，并用化學(xué)方法合成生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的對照品，進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。常用的動物有小鼠、大鼠、家兔和豚鼠等。

該方法可以綜合地考慮各種體內(nèi)因素對藥物的影響，能夠真實(shí)全面地反映藥物生物轉(zhuǎn)化的體內(nèi)整體特征。車慶明等[1]從口服黃芩苷的人尿液中，發(fā)現(xiàn)并鑒定了3個主要生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并確定了黃芩苷元是主要藥物生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的中間體，他們在體內(nèi)共存，構(gòu)成黃芩苷的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

本法的缺點(diǎn)是難度比較大，許多藥物在生物體內(nèi)的分布都比較廣，加上生物轉(zhuǎn)化的器官和酶系的多樣性，使藥物及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在體內(nèi)的濃度都比較低，檢測具有一定的難度。但是，現(xiàn)代分析技術(shù)的進(jìn)步和分析儀器靈敏度的提高將彌補(bǔ)傳統(tǒng)體內(nèi)方法的不足，充分體現(xiàn)此方法的優(yōu)越性。近年來不斷發(fā)展成熟的色譜-光譜聯(lián)用技術(shù)使得色譜分離和光譜鑒定成為一個連續(xù)的過程，它集色譜的高效分離與光譜的強(qiáng)鑒定能力于一體，分析快速方便，具有其他藥物生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檢測及結(jié)構(gòu)分析方法所不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。丁黎等[2]人通過收集給藥后大鼠膽汁，以液相/二級管陣列檢測器/質(zhì)譜檢測器聯(lián)用（LC/DAD/MSD）技術(shù)為基礎(chǔ)，確定了鹽酸非洛普的Ⅱ相生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

2 微透析取樣研究法[3,4]

微透析取樣研究法是20世紀(jì)60年代中期發(fā)展起來的在體藥物生物轉(zhuǎn)化研究方法，此后的20年間進(jìn)展不大，到80年代中期才有了長足的發(fā)展。微透析取樣法最初主要用于研究腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

微透析取樣裝置主要由微透析探針和微量取樣泵組成。長4～10mm的再生纖維透析膜固定在一根微徑導(dǎo)液管上構(gòu)成探針，外徑一般300μm左右，取樣窗口4～10mm；透析膜前有保護(hù)頭，可除去相對分子質(zhì)量＞50×103的分子。其原理如下：微型泵將灌注液泵入探針，灌注液與細(xì)胞外液組成完全一致時，透析膜不再發(fā)生水和離子交換，只有小分子物質(zhì)按濃度剃度原理進(jìn)、出探針?biāo)袢氲纳憝h(huán)境。進(jìn)入膜內(nèi)腔的位灌注液，透出膜內(nèi)腔的為透析液。

微透析取樣研究法可在清醒、自由活動狀態(tài)下的動物體內(nèi)多個器官以及同一器官多個位點(diǎn)連續(xù)取樣的實(shí)時在線分析；可連續(xù)跟蹤體內(nèi)多種化合物隨時間的變化；取樣無需勻漿過程，可真實(shí)代表取樣點(diǎn)化合物的濃度，且樣品因不含蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)，可不經(jīng)預(yù)處理直接用于測定；用于研究藥物生物轉(zhuǎn)化，可維持實(shí)際生理?xiàng)l件，消除了傳統(tǒng)藥物生物轉(zhuǎn)化研究中因組織均勻化破壞細(xì)胞隔室造成對生物轉(zhuǎn)化研究結(jié)果的影響，并可獲得有關(guān)藥物生物轉(zhuǎn)化中間過程的信息，而傳統(tǒng)方法只能了解藥物的最終產(chǎn)物，不能反映其中間過程。此外，微透析取樣研究法還具有能埋入動物體液或組織中、對周圍環(huán)境損傷很小的特點(diǎn)。由于取樣少，不會造成小動物失血過多而死亡，因此實(shí)驗(yàn)可以在同一動物身上進(jìn)行，從而避免了個體差異對試驗(yàn)結(jié)論準(zhǔn)確性的影響。

隨著各種類型微透析探針出現(xiàn)和商品化，以及微量快速、靈敏的分析檢測手段的不斷完善，微透析取樣技術(shù)結(jié)合色譜分析已成為藥物生物轉(zhuǎn)化研究的強(qiáng)有力手段。

3 藥物肝臟生物轉(zhuǎn)化研究法

肝臟含有大部分的生物轉(zhuǎn)化活性酶，而且具有很高的血流量，是藥物生物轉(zhuǎn)化最重要的器官。目前，肝臟生物轉(zhuǎn)化的體外研究方法中有肝微粒體法、肝細(xì)胞體外溫孵法、肝臟灌流技術(shù)、肝組織切片法、基因組P-450酶系、微透析技術(shù)等。

3.1 肝微粒體法[3]

肝微粒體法有在體和離體兩種方法。前者多首先用腹腔注射苯巴比妥鈉來誘導(dǎo)肝細(xì)胞色素P-450后再給予動物待研究藥物，通過測定原型藥物和其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在正常動物和給藥動物血清和組織中的分布來研究藥物，通過測定原型藥物和其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在正常動物和給藥動物血清和組織中的分布來研究藥物生物轉(zhuǎn)化。后者是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，在模擬生理溫度及生理環(huán)境條件下進(jìn)行生化反應(yīng)的體系。此法制備簡單，生物轉(zhuǎn)化時間短，易于重現(xiàn)，方便大量操作以積累生物轉(zhuǎn)化樣品供結(jié)構(gòu)研究；同時，該方法可用于對藥酶的抑制及體外生物轉(zhuǎn)化清除等方面的研究，因而應(yīng)用較為普及。目前利用此法研究確定了抗焦慮新藥[5]AF-5的兩個主要生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；結(jié)合整體動物實(shí)驗(yàn)，還基本闡明一葉 堿[6]在大鼠體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的途徑。廣泛應(yīng)用的肝微粒體制備流程[3]如圖1所示。

3.2 肝細(xì)胞體外溫孵法

肝細(xì)胞體外溫孵法同肝微粒體法相似，即以制備的肝細(xì)胞輔以氧化還原型輔酶，在模擬生理溫度及生理環(huán)境條件下進(jìn)行生化反應(yīng)的體系，適于研究蛋白及mRNA水平藥物代謝酶誘導(dǎo)及酶活性，在評估藥物生物轉(zhuǎn)化過程中藥物間的相互作用時，該方法得到廣泛的應(yīng)用。但肝細(xì)胞制備技術(shù)較復(fù)雜，目前以膠原酶灌注技術(shù)為主[7]，且體外肝細(xì)胞活性僅能維持4h，不利于儲存和反復(fù)使用。

3.3 離體肝灌流法

離體肝灌流法與肝微粒體法、肝細(xì)胞體外溫孵法相比，一方面保留著完整細(xì)胞的天然屏障和營養(yǎng)液的供給，因而能在一段時間內(nèi)保持肝臟的正常生理活性和生化功能；另一方面，具有離體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，能夠排除其他器官組織的干擾，可控制受試物質(zhì)的濃度，定量地觀察受試物質(zhì)對肝臟的作用。

Alexandra等[8]利用離體大鼠肝臟一過式灌流方法研究一種新的抗癌藥BR（苯甲酰胺核糖核苷）的體外代謝，分別以Wistar大鼠與TR2大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，灌流過程中每隔5rnin取樣1次，監(jiān)測BR及其代謝物，結(jié)果表明，Wistar大鼠灌流液中只有BR及其去氨基產(chǎn)物BR-COOH通過色譜檢測出來，而BAD（苯甲酰胺腺嘌呤雙核苷酸）未檢出TR2大鼠，灌流液的檢測結(jié)果與Wistar大鼠幾乎相同，但在BR與BR-COOH的檢出量上，TR2大鼠組低于Wistar大鼠組18%～23%。同時，應(yīng)用Wistar大鼠分離肝細(xì)胞，對不同濃度的BR（0～3mmol/L）進(jìn)行了溫孵實(shí)驗(yàn)，通過檢測，BAD仍然無法檢出。通過對BR的離體肝灌流與肝細(xì)胞體外溫孵實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，均發(fā)現(xiàn)BAD低于檢測限，未檢出，這說明BAD這種活性的代謝產(chǎn)物在大鼠肝臟中代謝率很低，BR-COOH為其主要的代謝途徑，故可推測，BR在人體的癌癥治療中，主要代謝生成為BR-COOH。當(dāng)前，離體肝灌流亦應(yīng)用于對藥物的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行考察。Christian等[9]運(yùn)用該方法考察了藥物CPT～11在膽汁中的排泄、清除速率及AUC等藥動學(xué)參數(shù)，取得了較好的結(jié)果。離體肝灌流法具有器官水平的優(yōu)勢，兼?zhèn)潴w外實(shí)驗(yàn)和整體動物實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，更適于定量研究藥物體外代謝行為和特點(diǎn)，并能解決在其他的體外肝代謝模型和整體動物實(shí)驗(yàn)中不能得到滿意解決的難點(diǎn)，在藥理學(xué)和毒理學(xué)的研究中已受到廣泛的重視，但其對實(shí)驗(yàn)設(shè)備及技術(shù)有一定的要求，一定程度上限制了其應(yīng)用。

3.4 肝組織切片法

該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以保留所有的肝藥酶及細(xì)胞器的活性，對于某些藥物生物轉(zhuǎn)化研究來說，有時采用肝組織切片技術(shù)比肝微粒體孵育更好.但由于該技術(shù)需要切片機(jī)等特殊的設(shè)備，因此近年來已經(jīng)很少被采用。Harris用肝切片技術(shù)研究了紫杉醇的生物轉(zhuǎn)化，得到了3個產(chǎn)物，且與紫杉醇的肝微粒生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物相同，說明了這一技術(shù)在藥物生物轉(zhuǎn)化研究上的可行性。

3.5 體外純化酶系統(tǒng)模擬法

由于肝臟中藥物生物轉(zhuǎn)化主要是由P-450酶系統(tǒng)催化反應(yīng)的，故可以通過純化的P-450同工酶、P-450混合酶來模擬體內(nèi)肝臟中酶系統(tǒng)，與藥物底物溫孵培養(yǎng)，來進(jìn)行藥物生物轉(zhuǎn)化研究。

4 藥物胃腸道生物轉(zhuǎn)化研究[3]

胃腸道是口服藥物的必經(jīng)通道，近來隨著人類對腸道菌不斷認(rèn)識，胃腸道作為藥物生物轉(zhuǎn)化的重要部位越來越引起研究者的重視。藥物在胃腸道各種酶的作用下可發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，酶主要包括兩部分，一部分是消化道上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的酶，主要是一些結(jié)合酶，另一部分就是消化道菌從產(chǎn)生的酶，主要以分解或還原反應(yīng)為主，其種類比肝臟還多。胃腸道的不同部位具有不同的菌群眾特點(diǎn)，如消化道下部主要是厭氧菌，因而也就有不同生物轉(zhuǎn)化特征。

與肝臟相比，腸內(nèi)菌群在藥物生物轉(zhuǎn)化的類型及功能上均有其獨(dú)特之處。肝臟對藥物兼有分解與合成的功能，多數(shù)藥物經(jīng)肝臟生物轉(zhuǎn)化后相對分子質(zhì)量增大，極性增強(qiáng)而易于從體內(nèi)排除，主要表現(xiàn)為解毒作用；腸內(nèi)菌群則幾乎全為分解反應(yīng)使藥物相對分子質(zhì)量減小，極性減弱，脂溶性增強(qiáng)，往往伴有藥效及毒性作用的增強(qiáng)。從某種意義上說，腸內(nèi)菌群對藥物的生物轉(zhuǎn)化可視為肝臟的補(bǔ)充或?qū)埂?/p>

4.1 藥物的胃液生物轉(zhuǎn)化研究[3]

在正常飼養(yǎng)條件下飼喂大鼠，絕食過夜，在厭氧條件下按35mg/mL劑量腹腔注射苯巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。再開腹、取胃。將胃內(nèi)容物全部洗出，黏附在胃壁上的內(nèi)容物用生理鹽水洗下，與胃內(nèi)容物合并，放入溫孵培養(yǎng)管內(nèi)，用厭氧稀釋液定容，37℃預(yù)溫卵培養(yǎng)一段時間（一般為30min）。然后再加入一定濃度的待研究轉(zhuǎn)化藥物，再在37℃培養(yǎng)一段時間或定時取樣分析。此法適合研究胃內(nèi)酶類的藥物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。

4.2 藥物的腸液生物轉(zhuǎn)化研究[3]

在厭氧條件下按上述方法（胃液的生生轉(zhuǎn)化研究）處理大鼠或小鼠，取出腸液，用厭氧稀釋液稀釋后在厭氧培養(yǎng)基內(nèi)厭氧預(yù)溫孵培養(yǎng)一段時間（一般為30min）。然后再加入一定濃度的待研究轉(zhuǎn)化藥物，再在37℃培養(yǎng)一段時間或定時取樣分析。此法適合研究腸內(nèi)細(xì)菌的藥物生物轉(zhuǎn)化，適合大規(guī)模制備轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。對研究多細(xì)菌或混僵細(xì)菌或腸內(nèi)菌叢的藥物轉(zhuǎn)化尤為合適。

4.3 腸內(nèi)菌生物轉(zhuǎn)化研究方法

4.3.1 全糞便溫孵法

該法目前應(yīng)用最廣泛的胃腸道生物轉(zhuǎn)化研究方法，由于腸道內(nèi)需氧菌只占腸道菌叢的極少部分，其絕大多數(shù)的厭氧菌是藥物生物轉(zhuǎn)化的主要角色，因此，糞便溫孵法主要就是制造適合厭氧菌生長的厭氧環(huán)境和營養(yǎng)條件，在此條件下，加入藥物與細(xì)菌混合、溫孵，然后檢測藥物原型成分和生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的種類和數(shù)量。使便出的厭氧菌存活下來的簡單而實(shí)用的方法[3]是：取一塑料袋，充滿二氧化碳?xì)猓ㄖ脫Q掉氧氣）。擠壓出來后，再次充滿二氧化碳?xì)猓磸?fù)數(shù)次，盡量將空氣排盡。然后裝入糞便（由于糞便部分不同，菌叢亦不同，因此要使用全便）。用手?jǐn)D壓使之均質(zhì)化。取均質(zhì)化的糞便2g，加入19mL厭氧菌稀釋液，培養(yǎng)，作為糞便菌液。

4.3.2 單一菌種溫孵法[3]

即用單一菌種與藥物共同進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，然后檢查藥物生物轉(zhuǎn)化情況的方法。目前，公認(rèn)的、有代表性的腸道菌有20多種，利用它們與藥物一同進(jìn)行溫孵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不如腸道混僵菌降解藥物明顯，但利用單一菌種降解藥物的條件易于控制，有利于有用的藥物生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的工程化生產(chǎn)以及新的菌種的發(fā)現(xiàn)。

4.3.3 簡單的大腸菌叢培養(yǎng)法

此法操作同簡單的結(jié)腸菌群培養(yǎng)研究法，只是操作對象是大腸內(nèi)容物而已。

4.3.4 腸菌酶法

腸菌酶法即把由腸菌中分得的酶作用于藥物，間接地研究腸道菌對藥物作用的方法。

4.3.5 結(jié)腸菌叢研究法[3]

4.3.5.1 簡單的結(jié)腸菌群培養(yǎng)研究法

在正常飼養(yǎng)條件下飼喂大鼠，絕食過夜。在厭氧條件下按35mg/mL劑量腹腔注射苯巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。再開腹、取結(jié)腸。將結(jié)腸內(nèi)容物全部洗出，黏附在結(jié)腸壁上的內(nèi)容物用厭氧菌稀釋液洗下，與結(jié)腸內(nèi)容物合并，放入溫孵培養(yǎng)管內(nèi)，用厭氧稀釋液定容，37℃溫孵培養(yǎng)一段時間或定時取樣分析。

此法的結(jié)腸菌所致的藥物轉(zhuǎn)化接近于真實(shí)情況，在中藥成分的腸內(nèi)細(xì)菌代謝或生物轉(zhuǎn)化研究中被廣泛應(yīng)用。

4.3.5.2 人結(jié)腸菌群體外模型法

現(xiàn)已建立不受宿主影響、適合研究微生物相互作用、細(xì)菌對藥物轉(zhuǎn)化活性的厭氧性連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的細(xì)菌菌叢在主要菌種、菌種多樣性等方面與接種糞便菌叢類似。但目前關(guān)于此方法的報道較少，體外模型法雖具有可控性等特點(diǎn)，但在研究哺乳動物及微生物等的酶所致外來化合物活化、毒性和藥效方面卻明顯不足。

4.3.5.3 人結(jié)腸菌叢在體模型法/無菌動物法

即取人糞便20%懸浮液1mL（相當(dāng)于細(xì)菌數(shù)為5×1010）給予健康成年無菌動物（一般采用大鼠），飼養(yǎng)在無菌隔離器內(nèi)。研究表明，人結(jié)腸菌叢酶的活性與定植在無菌大鼠的人腸內(nèi)菌叢酶的活性基本沒有區(qū)別。因此，此實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)是一個相當(dāng)好的模型。口服或靜脈給予的藥物經(jīng)肝腸循環(huán)進(jìn)入腸道內(nèi)的藥物都有可能被腸內(nèi)細(xì)菌所轉(zhuǎn)化，從而在動物組織或整個動物內(nèi)分泌中發(fā)現(xiàn)的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物實(shí)際上是藥物的腸內(nèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。因此，利用無菌動物研究藥物的腸內(nèi)細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化具有重要意義。

此外，將口服藥物給予無菌動物，然后測定動物組織或血中的藥物含量或生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，可排除藥物經(jīng)腸內(nèi)細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化的可能（對照組動物應(yīng)該是同種類的普通動物）。與同種類的悉生動物配合應(yīng)用可判斷腸內(nèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)化藥物的種屬特異性或生物轉(zhuǎn)化的連鎖性。如兒茶酚類化合物由腸內(nèi)菌生物轉(zhuǎn)化是利用悉生動物得到證明的[3]。給普通大鼠服用多巴胺，尿中有3-對羥基苯乙酸和酷胺排出，在無菌大鼠尿內(nèi)未發(fā)現(xiàn)這兩種物質(zhì)。這一結(jié)果與給予患者服用L-多巴后在服用新霉素導(dǎo)致3-1對差基苯乙酸和酷胺在尿中排出降低的結(jié)果是一致的。柴胡皂苷-b1是中藥柴胡主要的抗炎有效成分之一，它的藥物作用機(jī)制是通過無菌動物、悉生動物、普通動物聯(lián)合應(yīng)用揭示的。

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