姜紅紅，孟憲生，康廷國，包永睿

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600）

在我國甘草藥用歷史悠久，得到廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其有益氣補(bǔ)中、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效，有“十方九草”之說。據(jù)《中國藥典》2010年版一部記載其原植物有3種，即烏拉爾甘草G.uralensis Fisch.、脹果甘草G.inflate Bat.和光果甘草G.glabra L.[1]。甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黃酮、生物堿和氨基酸等化學(xué)成分，具有廣泛的生理活性[2]。甘草酸目前研究較深入，由于近年來人們發(fā)現(xiàn)其中黃酮類成分有較強(qiáng)的生物活性，已成為新的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)著眼于此，將對(duì)甘草總黃酮進(jìn)行提取純化工藝研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外可見光分光光度計(jì)（unico公司），安捷倫高效液相（Agilent 1100）（美國安捷倫公司），電子天平（ALC.1C.4）（Salto rius Group）。

1.2 試藥

聚酰胺、NKA-9、AB-8、D101、HPD-600、HPD-400、HPD-300大孔吸附樹脂（滄州寶恩有限公司），乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、冰醋酸（天津科密歐有限公司，分析純），乙腈（色譜純，Mtedia公司），甘草苷對(duì)照品（中國生物制品鑒定所，批號(hào)：111610-200604），甘草酸單銨鹽對(duì)照（中國生物制品鑒定所，批號(hào)：731-9403），甘草（經(jīng)本院翟延君教授鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.）。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草中總黃酮提取工藝的確定

2.1.1 方法

采用均勻設(shè)計(jì)[3]的方法確定考察因素為乙醇濃度、乙醇量、提取時(shí)間、提取次數(shù)、浸漬時(shí)間，并設(shè)定10個(gè)水平（表1）。將甘草生品粉碎（過60目篩），用天平精確量取分成若干袋，每袋凈含量15 g。取甘草15 g置于圓底燒瓶中，按照均勻設(shè)計(jì)表回流提取，合并提取液，提取液于100℃水浴中濃縮揮散溶劑，加水定容至100 ml，備用。

表1 黃酮類提取優(yōu)化均勻試驗(yàn)Tab.1 Flavonoid optimized uniform design programming

2.1.2 結(jié)果

2.1.2.1 UV 測(cè)定 取蘆丁對(duì)照品溶液 1、2、4、6、8、10 ml于 25 ml量瓶中，分別加入0.5 ml、10%硝酸鋁溶液，再用70%乙醇定容，UV檢測(cè)；樣品制備：取1 ml樣品溶液，同上法，進(jìn)行UV檢測(cè)。檢測(cè)波長：420 nm。結(jié)果見表2。

表2 紫外法對(duì)甘草物質(zhì)組中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 UV method determination results of total Flavonoids in Licorice material group

2.1.2.2 HPLC測(cè)定 樣品制備同“2.1.2.1”。取甘草苷對(duì)照品溶液（0.1 mg/ml）2、4、6、8、10 μl，進(jìn)樣，進(jìn)行 HPLC 檢測(cè)；色譜柱：Phenomenex-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流速：1 ml/min；柱溫：25℃；流動(dòng)相：A-B（0.5%磷酸水溶液∶乙腈）梯度洗脫：0～10 min時(shí) B 為 15%～25%；10～20 min時(shí) B為 25%～32%；20～25min時(shí)B為32%～40%；25～40 min時(shí) B為40%～55%。檢測(cè)波長：210、254、276、360 nm。 HPLC 測(cè)定結(jié)果見表 3。

表3 HPLC法對(duì)甘草物質(zhì)組中甘草苷含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 HPLC method determination results of liquiritin in Licorice material group

2.1.2.3 提取結(jié)果 提取方程為：Y=108.4481-2.2939X5+0.0024X12-1.2721X32+0.0140X52-0.0073X62+0.6708X1X2-0.0131X1X5-2.7631X2X3+0.0611X2X5+0.0102X5X6，Q=0.0013，S=0.0364，R=1，F(xiàn)10，1=14067.3121＞F10，10.05=242。 最佳提取工藝：乙醇濃度為90%，12倍乙醇量，提取1次，提取時(shí)間1 h，提取前浸漬時(shí)間為5 h。

2.2 甘草總黃酮純化工藝的確定

2.2.1 有機(jī)溶劑萃取總黃酮

取提取液 50 ml（0.15 g/ml），共 5份，分別加入石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮各50 ml，振蕩10 min，靜置30 min。分別取有機(jī)層，揮散溶劑，加入70%乙醇定容至50 ml，分別精密取2 ml，分別加入0.5 ml 10%硝酸鋁溶液，再用70%乙醇定容，UV檢測(cè)。結(jié)果見表4。

表4 不同提取溶媒提取總黃酮含量測(cè)定結(jié)果Tab.4 Contents of total Flavonoids with different extraction solvent

由表4可知，乙酸乙酯萃取液的總黃酮量最大而石油醚萃取液的總黃酮量最小，幾乎沒有，則選用石油醚萃取除去小極性物質(zhì)，水層再用乙酸乙酯萃取得總黃酮物質(zhì)組。以蘆丁為對(duì)照品經(jīng)UV測(cè)定計(jì)算純度為67.24%，所以考慮用樹脂[4]繼續(xù)純化。

2.2.2 樹脂靜態(tài)吸附與洗脫

靜態(tài)吸附：選取不同極性的樹脂NKA-9、HPD-600、聚酰胺、HPD-400、D-101、AB-8、HPD-300，各量取 10 ml與錐形瓶中，精密吸取樣品100 ml（相當(dāng)于原藥材30 g）放入錐形瓶中靜置24 h，過濾，濾液定容與100 ml量瓶中，備用。按“2.1.2”項(xiàng)下HPLC含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算吸附率，結(jié)果聚酰胺樹脂吸附率最大為87%。

靜態(tài)洗脫：過濾后的殘?jiān)鞣湃?00 ml 95%乙醇靜置24 h，過濾，濾液濃縮定容與100 ml量瓶中，備用。按“2.1.2”項(xiàng)下HPLC含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果聚酰胺樹脂解析率最大為47%，最終篩選出吸附率與解析率均最大的聚酰胺樹脂作為純化樹脂。

2.2.3 動(dòng)態(tài)吸附與解吸

2.2.3.1 泄露曲線 取聚酰胺樹脂20 ml上樹脂柱，上樣量為100 ml（0.15 g/ml），做泄露曲線，經(jīng)泄露曲線得最大上樣量為90 ml（0.15 g/ml）。

2.2.3.2 動(dòng)態(tài)吸附與解析 通過正交設(shè)計(jì)，選取因素為上樣濃度、流速、徑高比、上樣液 pH值，并設(shè)定3個(gè)水平，做 L9（34）正交試驗(yàn)，以HPLC測(cè)定結(jié)果為指標(biāo)確定最佳純化工藝。得上樣液pH值項(xiàng)有顯著性差異，得最佳樹脂純化工藝為上樣液PH值為5，流速為1 ml/min，徑高比為1/10，上樣濃度為0.15 g/ml。再對(duì)解析液進(jìn)行考察：選擇90%、80%、70%、60%、50%乙醇分別進(jìn)行洗脫，洗脫液濃縮定容備用，按“2.1.2”項(xiàng)下UV含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果確定70%乙醇洗脫為最佳洗脫液；再對(duì)解析液用量進(jìn)行考察：選擇3BV、4BV、5BV、6BV、7BV 70%乙醇洗脫液濃縮，定容，備用，按“2.1.2”項(xiàng)下UV含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定計(jì)算6BV 70%乙醇洗脫液純度為81.74%，為最高純度，所以確定洗脫液為6 BV 70%乙醇。由于純度不理想，所以選用乙酸乙酯又進(jìn)行萃取純化結(jié)果純度為87.41%，純度沒有達(dá)到90.00%，則選用同樣條件再過一次聚酰胺樹脂，以蘆丁為對(duì)照品經(jīng)UV測(cè)定計(jì)算出純度為90.12%。

3 討論

通過均勻試驗(yàn)結(jié)合回流的提取方法，全面地考察了總黃酮提取所涉及的因素與水平，因?yàn)榫鶆蛟O(shè)計(jì)考察的水平數(shù)量較均勻設(shè)計(jì)多，使結(jié)果更加合理。

通過UV檢測(cè)總黃酮并輔以HPLC測(cè)定甘草苷含量，結(jié)果均顯示總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度為90%，12倍乙醇量，提取1次，提取時(shí)間1 h，提取前浸漬時(shí)間為5 h。增加浸漬時(shí)間，減少加熱回流提取時(shí)間和提取次數(shù)，節(jié)省了能源。

通過樹脂動(dòng)靜態(tài)考察最終確定過2遍聚酰胺樹脂且聚酰胺的粒度為200～300目。通過石油醚萃取除去大部分小極性物質(zhì)使純度達(dá)到67.00%；通過有機(jī)萃取結(jié)合樹脂工藝有效地純化甘草總黃酮，使其純度達(dá)到90.12%。

通過有機(jī)溶劑萃取時(shí)，把極性相似的三萜類同時(shí)提取出來了，導(dǎo)致純度一直上不去太高，所以通過樹脂柱來進(jìn)行進(jìn)一步純化；選擇了不同極性又是常用與黃酮醇化的樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附與解析，選擇出最佳吸附率尤其最佳解析率的聚酰胺樹脂進(jìn)行純化實(shí)驗(yàn)[4-8]；首先對(duì)聚酰胺樹脂的最大上樣量進(jìn)行動(dòng)態(tài)考察，通過以甘草苷為指標(biāo)的HPLC含量測(cè)定繪制出泄露曲線并確定最大上樣量為90 ml（0.15 g/ml）；確定最大上樣量之后，又對(duì)動(dòng)態(tài)樹脂吸附條件通過L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行了考察，得到最佳樹脂動(dòng)態(tài)吸附條件；對(duì)樹脂動(dòng)態(tài)解析條件進(jìn)行摸索，通過UV測(cè)得含量最終確定最佳解析條件為6 BV入70%乙醇洗脫；由于純度仍不理想嘗試用有機(jī)溶劑在萃取純度仍上不去，且考慮到毒性，所以又一次選擇聚酰胺樹脂用相同靜動(dòng)態(tài)條件進(jìn)行純化經(jīng)UV含量測(cè)定純度為90.12%。

通過均勻試驗(yàn)確定了甘草黃酮類的最佳提取工藝為乙醇濃度為90%，12倍乙醇量，提取1次，提取時(shí)間1 h，提取前浸漬時(shí)間為5 h。通過有機(jī)萃取試劑篩選實(shí)驗(yàn)確定選用石油醚萃取的方法除去小極性物質(zhì)，水層再用乙酸乙酯萃取得總黃酮物質(zhì)組，純度可達(dá)67%；通過樹脂動(dòng)靜態(tài)的考察結(jié)合正交試驗(yàn)確定甘草總黃酮物質(zhì)組最佳工藝參數(shù)即選用聚酰胺樹脂；上樣液pH值為5，流速為1 ml/min，徑高比為1/10，上樣濃度為0.15 g/ml；洗脫液為6 BV 70%乙醇；且以相同條件過2遍聚酰胺樹脂，純度最終達(dá)到90%。通過UV、HPLC儀器的檢測(cè)建立了測(cè)定甘草黃酮類含量的分析方法，為甘草的質(zhì)量控制提供一定依據(jù)。通過一系列的提取與純化實(shí)驗(yàn)，最終確定了甘草總黃酮的提取純化工藝參數(shù)，為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究及有效物質(zhì)組的機(jī)制研究提供科學(xué)可信合理有效物質(zhì)基礎(chǔ)。

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