劉莎莎，陳小龍

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院發(fā)酵工程研究所，浙江杭州 310032)

灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)屬于半知菌亞門(Hyphomycetes)絲孢綱 (Deuteromycotina)葡萄孢屬，是一種植物病原真菌，宿主達200余種，其中包括重要的經(jīng)濟作物葡萄、番茄、草莓等。在植物的生長期、開花期、結(jié)果期及運輸儲藏期灰葡萄孢都可以感染作物，所以由灰葡萄孢引起的灰霉病被認為是最嚴(yán)重的植物真菌病害之一。每年都有關(guān)于灰葡萄孢感染新的作物品種的相關(guān)報道，在環(huán)境適宜的條件下，特別是溫室培養(yǎng)，灰霉病會大面積爆發(fā)，帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失［1－3］。

目前抗灰霉病的方法主要集中在化學(xué)防治和生物防治2方面［4］，我國防治灰霉病使用的藥劑主要包括苯丙咪唑類 (如多菌靈)，二甲酰亞胺類 (如速克靈)和氨基甲酸酯類 (如乙霉威)殺菌劑，國外也有一些通過控制作物栽培氣候條件和培養(yǎng)抗灰葡萄孢植株來抵抗灰霉病的相關(guān)報道［5－7］。由于化學(xué)防治容易產(chǎn)生抗性，生物防治和其它舉措還沒有特別行之有效的方法［8－10］，所以找到對灰霉病有特效的殺真菌劑是全世界范圍內(nèi)急需解決的難題。

灰葡萄孢在進入植物組織之前先殺死細胞，然后吸取植物的營養(yǎng)，這個過程中灰葡萄孢會分泌多種有毒的代謝產(chǎn)物和胞外酶。目前國內(nèi)外對灰葡萄孢致病機理研究的重點都集中在這些致病因子的合成途徑以及作用方式。

1 灰葡萄孢毒素

灰葡萄孢毒素成分種類很多，國外已分離出將近20種化合物，這些毒素中最為關(guān)鍵的是二環(huán)倍半萜烯botrydial和高取代內(nèi)酯 botcinolide，其它鑒定出結(jié)構(gòu)的毒素都為這2種物質(zhì)的前體或衍生物，毒性相對較低。

botrydial最早在1974年被分離鑒定出來，botcinolide最早在1993年被分離鑒定出來，它們的結(jié)構(gòu)式如圖1所示［11－12］。所有已經(jīng)分離鑒定出的灰葡萄孢毒素中，botrydial的毒性最高，活體實驗結(jié)果表明，灰葡萄孢分泌botrydial越多，其對宿主細胞表現(xiàn)出的毒力就越高［13］。目前國內(nèi)外的研究都集中在botrydial的致病機理以及生物合成途徑方面。

圖1 botrydial和botcinolide的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.1 botrydial和以灰霉二醛為骨架的化合物

很多絲狀真菌的毒力都是萜類化合物引起的，這些化合物幫助植物真菌突破宿主的細胞防御。botrydial是非特異性毒素，可以作用于不同作物和基因型，正是因為這樣灰霉病才能引發(fā)大面積的植物病害。Isidro等人發(fā)現(xiàn)，被灰葡萄孢侵染的宿主植物出現(xiàn)傷口后，植物組織細胞中就可以檢測到botrydial，但植物本身并不能分泌這種化合物。隨著植物葉片上萎黃程度增高，檢測到botrydial的量也增加，所以灰葡萄孢分泌的二環(huán)倍半萜類毒素被認為是灰霉病致病的關(guān)鍵因素，這些毒素可以引發(fā)宿主植物萎黃病和組織細胞破裂［14］。Colmenares等［15］發(fā)現(xiàn)，botrydial的活性具有光依賴性，光照條件下botrydial引發(fā)宿主產(chǎn)生病斑的能力比黑暗條件下高出1倍，但其機理還未闡明。

灰葡萄孢在液體培養(yǎng)時除了會產(chǎn)生botrydial外，發(fā)酵液中還發(fā)現(xiàn)了大量以灰霉二醛為骨架的二環(huán)倍半萜類毒素，這些含灰霉二醛骨架化合物的生物活性存在一定差異。通過比較后發(fā)現(xiàn)，這些化合物的生物活性與灰霉二醛骨架結(jié)構(gòu)上C-10和C-15原子的氧化態(tài)以及C-9上的羥基有直接關(guān)系［16］。

1.2 botrydial的生物合成途徑和相關(guān)基因

了解botrydial及其相關(guān)化合物的合成途徑對灰霉病致病性的研究具有重大意義。最近，合成botrydial的基因簇及其編碼的蛋白序列已經(jīng)鑒定出來，5個合成botrydial基因簇的開放閱讀框及功能如圖2所示［17］。BcBOT2負責(zé)編碼的蛋白是1種倍半萜合酶，將FPP(法呢基焦磷酸)環(huán)化生成關(guān)鍵的中間產(chǎn)物 PSP(presilphiperfolan-8βol)，隨后PSP在3種單加氧酶細胞色素 P450(BcBOT3，BcBOT1，BcBOT4編碼)和乙酰轉(zhuǎn)移酶 (BcBOT5編碼)的作用下生成 botrydial。botrydial的生物合成途徑如圖 3 所示［18］。

圖2 合成botrydial基因簇的開放閱讀框及功能

圖3 botrydial的生物合成途徑

在5個基因簇中，最重要的是1.2 kb的BcBOT2基因，它負責(zé)編碼倍半萜合酶，此酶是botrydial合成途徑中的關(guān)鍵酶。敲除BcBOT2基因的灰葡萄孢菌株失去了合成botrydial和相關(guān)化合物的能力，菌株毒力基本喪失［18］。PSP轉(zhuǎn)化成botrydial的過程中涉及到多種以灰霉二醛為骨架的化合物，這些化合物在整個途徑中起到中間體的作用。

1.3 灰葡萄孢毒素的應(yīng)用

灰葡萄孢產(chǎn)生的毒素會引發(fā)植物枯萎死亡，特別是大部分雙子葉植物。botrydial在1.0 μg·mL－1的濃度下就可以使植物葉片表現(xiàn)典型的癥狀，botcinolide在濃度為10－3mol·L－1時對某些單子葉和雙子葉植物就有很強的抑制或殺除作用，但這2種化合物及其相關(guān)化合物對小鼠的毒性都不高［13］，所以灰葡萄孢毒素可以作為生物除草劑進行開發(fā)利用，國內(nèi)外對灰葡萄孢毒素的研究也都集中在除草劑方向。Cutler在1995年申請了botcinolide應(yīng)用為除草劑的專利，鄭蒙等［19］對灰葡萄孢發(fā)酵液中的除草活性組分進行純化和結(jié)構(gòu)鑒定，得到有望開發(fā)為生物除草劑前體的10-順-二氫化灰霉二醛。

2 與致病性相關(guān)的胞外酶

灰葡萄孢侵染植物組織并導(dǎo)致植物死亡的過程一般從孢子開始，分生孢子成熟后脫落，借氣流、雨水傳播附著在植物表面，再萌發(fā)出芽管形成菌絲。灰葡萄孢突破植物體表面屏障入侵細胞，再將植物組織降解為可供真菌利用的能量，這一整個過程都要依賴胞外酶的協(xié)同作用［20］。

2.1 與破壞宿主表面屏障相關(guān)的酶

植物表面都有一層起保護作用的表皮，這層表皮由角質(zhì)和脂肪酸構(gòu)成，此外許多植物表面還有一層由脂肪醇組成的疏水蠟質(zhì)層。角質(zhì)的主要成分是單、雙及三羥基脂肪酸，這些羥基脂肪酸通過酯鍵相互連接。表皮細胞壁的角質(zhì)化以及角質(zhì)層和蠟質(zhì)層的存在使整個植物表面形成堅固的疏水層抵御病原菌的侵害。

灰葡萄孢感染植物從植物表面開始進行，即使宿主表面不存在傷口，灰葡萄孢的孢子也能由植物表皮直接入侵宿主引起發(fā)病，但有創(chuàng)口或死亡的植物組織更容易感染灰霉病。這是因為灰葡萄孢入侵宿主表面時能分泌減小宿主表面疏水性并分解蠟質(zhì)層的蛋白及代謝物，為其它致病因子提供了入口。這些分泌物起到表面活化劑的作用，也就是減小了宿主的表面張力，在此過程中起作用的胞外酶包括了角質(zhì)酶、絲氨酸酯酶、脂酶和其它非特異性酯酶。表1涵蓋了一些協(xié)助灰葡萄孢破壞宿主表面屏障的酶和這些酶起到的作用［21－25］。

表1 與灰葡萄孢破壞宿主表面相關(guān)的胞外酶及功能

2.2 與利用植物能量相關(guān)的酶

灰葡萄孢的孢子穿過植物表面保護層后萌發(fā)為菌絲，分泌大量可分解植物組織的胞外酶，這些酶將植物細胞中的多糖降解為可供真菌利用的生物量。植物細胞壁由多種多糖組成，其中主要的組成是纖維素和半纖維素，胞間層則含有大量的果膠質(zhì)，這個階段灰葡萄孢產(chǎn)生的與致病性相關(guān)的酶主要是纖維素酶、半纖維素酶等細胞壁降解酶和果膠酶。

2.2.1 纖維素酶和半纖維素酶

灰葡萄孢在纖維素的誘導(dǎo)下分泌纖維素水解酶，將植物細胞壁中的纖維素分解為纖維二糖和葡萄糖。體外實驗證明，當(dāng)培養(yǎng)基中加入果膠時纖維素酶的產(chǎn)量會增加，而葡萄糖和纖維二糖則會抑制纖維素酶分泌［26］?；移咸焰叻置诘睦w維素水解酶包括 β-葡萄糖苷酶，1，4-β-D-葡聚糖內(nèi)切酶和1，4-β-D-葡聚糖外切酶，其中β-葡萄糖苷酶既有胞內(nèi)酶也有胞外酶，但在灰葡萄孢侵染植物的過程中，只有胞外酶作用于植物細胞，胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶與灰葡萄孢的致病性沒有關(guān)聯(lián)［27］?；移咸焰叩逆咦訜o論是在萌發(fā)前還是萌發(fā)后都沒有檢測到纖維素酶的活性，說明纖維素酶只在灰葡萄孢進入宿主后起作用。

植物細胞壁中的半纖維素是由木聚糖和阿拉伯糖組成的，有報道稱灰葡萄孢侵染植物后分泌出3種木聚糖酶和1種阿拉伯糖酶［28］，其它關(guān)于灰葡萄孢分泌半纖維素酶的研究幾乎沒有。

2.2.2 果膠酶

植物的細胞壁和胞間層中都含有大量的果膠質(zhì)，在灰葡萄孢侵染植物的過程中會產(chǎn)生多種可以降解果膠的酶，它們在降解果膠的過程中起著不同的作用，協(xié)助灰葡萄孢分解果膠的酶及其功能如表2 所示［29－33］。

表2 灰葡萄孢分泌的果膠酶及功能

Movahedi等在經(jīng)灰葡萄孢侵染后壞死的植物細胞中發(fā)現(xiàn)了多外聚半乳糖醛酸酶，果膠裂合酶和果膠酸裂解酶。果膠酸裂解酶在孢子中就存在，但在灰葡萄孢侵染宿主的起始階段不發(fā)揮作用，而多外聚半乳糖醛酸酶在灰葡萄孢侵染宿主的早期就開始發(fā)揮作用，黃瓜葉片接種灰葡萄孢9 h后就能檢測到多外聚半乳糖醛酸酶。此外，在大豆下胚軸和南瓜果實中都檢測到果膠裂合酶和果膠酸裂解酶，而蘋果組織中卻沒有檢測它們的酶活。體外實驗發(fā)現(xiàn)這兩種酶在酸性pH下會失活，所以這2種酶在酸性的蘋果組織內(nèi)失活，此外果膠裂合酶還需要Ca2+離子起協(xié)同作用［31－33］。

3 展望

灰葡萄孢引起的灰霉病是世界性的重要病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了極大危害。幾十年來大面積使用化學(xué)藥劑防治灰霉病帶來了嚴(yán)重的后果，抗藥性的菌株大量出現(xiàn)，土地污染和水污染都日趨嚴(yán)重。發(fā)展靶標(biāo)性的抗灰霉病藥物成為目前研究的熱點，靶標(biāo)性的抗菌劑只作用于目標(biāo)微生物，而不作用于其它生物，對于保持生態(tài)系統(tǒng)的平衡十分有利。

設(shè)計靶標(biāo)性的抗菌劑需要了解病原真菌代謝產(chǎn)物的合成途徑以及對植物的作用機理，灰葡萄孢的代謝產(chǎn)物包括酶類、多糖、植物激素、毒素和脂肪酸酯類等，其中酶類、毒素和植物激素是重要的致病因子。致病因子作用于植物是一個復(fù)雜的過程，近年來更多的研究由致病因子的作用機制轉(zhuǎn)向編碼相關(guān)致病因子的基因與合成途徑，對這些基因及調(diào)控機理的研究必將極大地促進新型抗灰霉病藥物的研制和發(fā)展。

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