倪國仕，章新軍，畢慶文，王 瑞*

（1.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；2.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢 430051）

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）是煙草病毒病主要的毒源之一，煙草感染TMV后，常出現(xiàn)花葉或壞死及矮化畸形等癥狀，正常的生理功能受到不同程度的影響。光合作用是綠色植物最重要的生命活動，植物感染病毒后光合作用一般都會受到影響，已有研究表明，受病毒侵染后植物的光合速率明顯下降，葉綠體受到破壞，葉綠素含量降低，光合電子傳遞活力下降，光合磷酸化作用降低[1-4]。Wilhelmova等[5]曾研究了受TMV侵染后煙草葉中光合色素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，劉國順等[6]曾報(bào)道受 TMV侵染后煙草葉中保護(hù)酶活性和超微機(jī)構(gòu)的變化。本試驗(yàn)研究了受TMV侵染程度不同的煙草葉片光合氣體交換參數(shù)、光合色素含量以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，旨在進(jìn)一步探討病毒影響植物光合作用的生理生化機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于 2009年在湖北省恩施州宣恩縣煙草示范田進(jìn)行，材料為烤煙品種云煙87。黃棕壤土，土層深厚，質(zhì)地偏粘，pH為5.6，有機(jī)質(zhì)為24.2 g/kg，堿解氮為 135.15 mg/kg，速效磷為 21.42 mg/kg，速效鉀為195.00 mg/kg。在煙株旺長期，通過感病癥狀確定主要受TMV侵染的煙株，選取正常株、輕度感病株（有輕微花葉癥狀，感病植株只在葉片上形成黃綠相間的花葉病駁，葉片基本不變，但葉肉會出現(xiàn)明顯變薄或厚薄不均的癥狀）和重度感病株（花葉明顯且葉片嚴(yán)重畸形葉緣逐漸形成缺刻并向下卷曲，皺縮扭曲）。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 光合氣體交換參數(shù)的測定 在晴天上午9:30—10:30，采用美國Licor公司生產(chǎn)的LI-6400便攜式光合測定系統(tǒng)測定凈光合速率（Pn），氣孔導(dǎo)度(Gs)，胞間 CO2濃度（Ci），氣孔限制值（Ls）＝1－Ci/Co（Co為葉外空氣 CO2濃度）。人工控制條件為：CO2濃度 380 μmo1/mol，25℃，光照強(qiáng)度 l 000 μmol/(m2·s)。每個處理3株，選取中部葉（自下而上第 10位葉）進(jìn)行光合參數(shù)的測定，每株測定 2次，取其平均值。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 同步用英國Hansatech公司生產(chǎn)的 FMS2脈沖調(diào)制式熒光儀測定光適應(yīng)條件下的穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）和穩(wěn)態(tài)最大熒光（Fm′），葉片經(jīng)暗適應(yīng)30 min后初始熒光（F0）和最大熒光（Fm），并計(jì)算PSⅡ活性（Fv/F0）、PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)換效率（Fv/Fm）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（qp）、非光化學(xué)猝滅系數(shù)（NPQ）和電子傳遞的量子產(chǎn)率（ΦPSⅡ），分別按下式計(jì)算[7]：Fv/F0=（Fm-F0）/F0，F(xiàn)v/Fm=（Fm-F0）/Fm，qp=（Fm′-Fs）/（Fm′-F0），NPQ=（Fm-Fm′）/Fm′，ΦPSⅡ=（Fm-Fs）/Fm′。

1.2.3 光合色素的測定 同步用直徑1 cm打孔器取鮮葉，用80%丙酮研磨提取，以UV-754型分光光度計(jì)（上海亞研電子科技有限公司）測定 663、646、和470 nm處的OD值，然后計(jì)算單位面積葉綠素和類胡蘿卜素含量[8]。

2 結(jié) 果

2.1 TMV侵染對煙草葉片氣體交換參數(shù)的影響

從表1可見，與正常株相比，輕度感病株葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci）分別下降了 26.05%、73.08%和 55.76%，氣孔限制值（Ls）上升了 151.85%，差異均達(dá)到顯著水平；重度感病株葉片Pn、Gs和Ls分別下降了44.61%、50.03%和18.51%，差異均達(dá)到顯著水平，Ci上升了3.76%，但差異未達(dá)到顯著水平。

表1 TMV侵染對煙草葉片凈光合速率，氣孔導(dǎo)度，胞間CO2濃度和氣孔限制值的影響Table 1 Effects of TMV infection on net photosynthetic rate, stomatal conductance, intercellular CO2 concentration and stomatal limitation value of tobacco leaves

2.2 TMV侵染對煙草葉片光合色素含量的影響

從表2可見，受TMV侵染的葉中葉綠素和類胡蘿卜素含量均有下降。與正常株相比，輕度感病株葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b和類胡蘿卜素分別下降了 16.28%、17.18%、16.55%和16.89%，除類胡蘿卜素外，其他均未達(dá)到顯著水平；重度感病株分別下降了 56.13%、58.69%、56.83%和57.03%，均達(dá)到顯著水平。不同感病程度煙株葉片葉綠素a/葉綠素b和葉綠素/類胡蘿卜素的比值與正常株接近，變化不大。

表2 TMV侵染對煙草葉片光合色素含量的影響Table 2 Effects of TMV infection on photosynthetic pigment content of tobacco leaves

2.3 TMV侵染對煙草葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

從表3可見，受TMV侵染的葉片各熒光參數(shù)均有下降。與正常煙株相比，輕度感病株葉片F(xiàn)v/Fm、Fv/F0、qp、NPQ和ΦPSⅡ分別下降了1.22%、6.40%、4.60%、31.03%和4.55%，除NPQ外，其他均未達(dá)到顯著水平；重度感病株葉片分別下降了17.07%、50.90%、32.18%、75.86%和 40.91%，均達(dá)到顯著水平。

表3 TMV侵染對煙草葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Table 3 Effects of TMV infection on chlorophyll fluorescence parameters of tobacco leaves

3 討 論

通過對受TMV侵染的煙草葉片光合氣體交換參數(shù)、光合色素以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化分析，可以看出TMV對寄主植物光合作用的影響與其他病毒相似。本研究中受TMV侵染葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量均有所下降，其主要原因可能是病毒侵染寄主植物后使其葉綠素分解酶的活性增加，或使葉綠素酯的含量降低，從而導(dǎo)致葉綠素含量下降而產(chǎn)生淺綠和暗綠相間的花葉癥狀，致使光合作用面積減少[9]；也有可能是 TMV侵染后破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致葉綠素含量的下降[6]；類胡蘿卜素既是光合色素，又是內(nèi)源抗氧化劑，除在光合作用中具有一定的功能外，在細(xì)胞內(nèi)還可吸收剩余能，猝滅活性氧，從而防止膜脂過氧化[10]。由于類胡蘿卜素含量的降低，減少其對活性氧的猝滅，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)積累較多的氧自由基，破壞了葉綠體膜結(jié)構(gòu)，加速了葉綠素的分解[11]。

葉綠素?zé)晒饨?jīng)常被用于評價(jià)光合機(jī)構(gòu)的功能和環(huán)境脅迫對其的影響[12]，本實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果表明，TMV重度侵染可以明顯降低Fv/F0、Fv/Fm和ΦPSⅡ，同時qp和NPQ也明顯表現(xiàn)出下降的趨勢。Fv/F0代表PSⅡ活性[13]，其值的降低表明受TMV侵染煙草葉片PSⅡ活性失活，而在TMV侵染下煙草葉片葉綠素含量下降較快和ΦPSⅡ降幅較高的結(jié)果表明，光系統(tǒng)失活的可能原因是 PSⅡ天線色素或色素蛋白復(fù)合體受到破壞[14]；Fv/Fm的下降表明，受TMV侵染煙草葉片的光合機(jī)構(gòu)受到一定程度的破壞，因而，對光能的吸收和轉(zhuǎn)化效率明顯下降[15]；qp反映的是 PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)傳遞的份額，要保持高的光學(xué)猝滅就要使PSⅡ反應(yīng)中心處于開放狀態(tài)，所以qp也反映了 PSⅡ反應(yīng)中心開放程度，qp值的降低表明PSⅡ反應(yīng)中心受體QA的還原程度更高，開放部分比例下降，關(guān)閉部分比例提高，這些關(guān)閉狀態(tài)的PSⅡ反應(yīng)中心不能進(jìn)行穩(wěn)定的電荷分離，因而不能參與光合電子的傳遞[9]；NPQ代表PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱能的形式耗散部分，Wilhelmova等[5]認(rèn)為受TMV侵染的煙草葉片的NPQ值是上升的，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著TMV侵染程度的加重，NPQ值逐漸降低，下降的可能原因是在熱耗散和清除活性氧方面起重要作用的類胡蘿卜素含量大幅下降，導(dǎo)致光合機(jī)構(gòu)易受到破壞，耗散過剩光能的能力減弱。

引起葉片光合速率降低的植物自身因素不外乎氣孔的部分關(guān)閉和葉肉細(xì)胞光合活性下降兩類，前者使胞間CO2濃度（Ci）降低，而后者使Ci增高。當(dāng)兩種因素同時存在時，變化的方向依賴于占優(yōu)勢的那個因素。也就是說，當(dāng)氣孔的部分關(guān)閉是葉片光合速率降低的主要原因時，Ci降低；而當(dāng)葉肉細(xì)胞光合活性降低是葉片光合速率降低的主要原因時，Ci增高[16]。根據(jù)Farquhar和Sharkey[17]提出的氣孔限制值分析觀點(diǎn)，判定引起葉片光合速率降低主要因素的主要根據(jù)是Ci和氣孔限制值（Ls）的變化方向，Ci降低和Ls升高表明氣孔導(dǎo)度降低是主要原因，而Ci增高和Ls降低則表明引起光合速率降低的主要原因是非氣孔因素。從本研究結(jié)果來看，受 TMV侵染的煙草葉片的凈光合速率（Pn）明顯下降，且隨著感病程度的增加，Pn下降的程度增大，但不同感病程度引起Pn下降的主要原因不同。在輕度感病條件下，伴隨著氣孔導(dǎo)度（Gs）的下降，Ci降低和Ls升高，表明引起Pn下降的主要原因是氣孔限制。在重度感病條件下，伴隨著氣孔導(dǎo)度（Gs）的下降，Ci增高和Ls降低，表明引起Pn下降的主要原因是非氣孔限制及葉肉細(xì)胞光合活性的下降。

由此可以推測，TMV輕度侵染主要是引起煙草葉片氣孔關(guān)閉或堵塞，阻礙了氣體的交換，從而影響到葉片的光合作用，隨著侵染程度的加重，光合色素含量大幅減少，光合機(jī)構(gòu)損傷嚴(yán)重，葉片光合作用進(jìn)一步受到影響。

[1]Culver J N, Lindbeck A G C, Dawson W O.Virus-host interactions:induction of chlorotic and necrotic responses in plants by tobacco mosaic virus[J].Annu Rev Plant Pathol., 1991, 29: 193-217.

[2]郭興啟，溫孚江，朱漢城.煙草感染馬鈴薯 Y病毒（PVY）后光合作用的變化規(guī)律[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2000，26（1）：75-78.

[3]王春梅，施定基，朱水芳, 等.黃瓜花葉病毒對煙草葉片和葉綠體光合活性的影響[J].植物學(xué)報(bào)，2000，42（4）：388-392.

[4]何金祥，黃寧珍，付傳明，等.煙草花葉病毒對煙草葉片光合特征和 POD表達(dá)的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2009，29（5）：0961-0967.

[5]Wilhelmová N, Procházková D, ?indelárová M, et al.Photosynthesis in leaves of Nicotiana tabacum L.infected with tobacco mosaic virus[J].Photosynthetica,2005, 43(4): 597-602.

[6]劉國順，張彩霞，王嬋娟，等.受烤煙花葉病病毒侵染后葉中保護(hù)酶活性和超微結(jié)構(gòu)的變化[J].植物生理學(xué)通訊，2009，45（5）：459-463.

[7]馬新明，李春明，田志強(qiáng)，等.鎘污染對烤煙光合特性、產(chǎn)量及其品質(zhì)的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（12）：4039-4044.

[8]李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2000：134-137.

[9]李燕宏，洪健，謝禮，等.蠶豆萎蔫病毒2號分離物侵染對蠶豆葉片光合活性和葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2006，32（4）：490-496.

[10]王大平，曾明，朱均，等.綠斑病藻寄生對夏橙葉片光合作用特性的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，17（6）：1141-1144.

[11]Sakaki T, Kondo N, Sugahra K.Breakdown of photosynthetic pigment and lipids in spinach leaves ozone fumigation:Role of active oxygen[J].Physiol Plant,1983, 59: 28-34.

[12]Lichtenthaler H K, Buschmann C, Rinderlel V, et al.Application of chlorophyll fluorescence in ecophysiology[J].Radiation and Environmental Biophysics, 1986, 25: 297-308.

[13]張其德，劉合芹，張建華，等.限水灌溉對冬小麥旗葉某些光合特性的影響[J].作物學(xué)報(bào)，2000，26（6）：869-873.

[14]Saitanis C J, Riga-Karandinos A N, Karandinos M G.Effects of ozone on chlorophyll and quantum yield of tobacco(Nicotiana tabacum L.) varieties[J].Chemosphere, 2001, 42: 945-953.

[15]張乃華，高輝遠(yuǎn)，鄒琦.Ca2+緩解 NaCl脅迫引起的玉米光合作用下降的作用[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，29（2）：324-330.

[16]許大全.光合作用氣孔限制分析中的一些問題[J].植物生理學(xué)通訊，1997，33（4）：241-244.

[17]Farqhar G D, Sharkey T D.Stomatal conductance and photosynthesis[J].Annual Review of Plant physiology,1982, 33: 317-345.