吳相春， 來 靜， 李愛然， 賈振華， 王洪濤

(1河北醫(yī)科大學中西醫(yī)結合教研室，河北 石家莊 050017;2河北中西醫(yī)結合醫(yī)藥研究院絡病研究室，河北 石家莊 050035;3石家莊市第三醫(yī)院急診科，河北 石家莊 050017)

低氧或缺氧是心、肺、腦血管病等常見病患者的基本病理過程。預適應是生物界中普遍存在的生物自我保護機能，缺氧預適應具有強大的保護和防御作用，效果極其肯定，但確切機制仍不明確。既往研究證實通心絡具有明顯的保護血管和神經的作用，但確切機制仍不明確。細胞凋亡是機體維持細胞群體數(shù)量穩(wěn)態(tài)的重要手段，細胞凋亡失調是心腦血管疾病的重要發(fā)病機制。本研究觀察缺氧預適應小鼠自身凋亡機制的變化以及通心絡的干預作用并對其機制進行探討。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 標化動物雄性昆明小鼠80只，購于北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，許可證號為SCXK(京)2006－0008。

1.2 試劑及儀器 缺氧誘導因子－1α(hypoxia inducible factor－1α，HIF－1α)抗體，購自 Abcam;B細胞白血病/淋巴瘤相關抗原相關X蛋白(Bcl－associated X，Bax)、B細胞白血病/淋巴瘤相關抗原2(B－cell leukemia/lymphoma 2，Bcl－2)抗體，購自Santa Cruz;120 mL廣口瓶120個;秒表 20個;橡膠塞60個。

1.3 藥物 通心絡超微粉，為棕褐色粉末，味苦，1.46 g生藥/g干粉，石家莊以嶺藥業(yè)有限公司提供。

2 方法

2.1 動物分組 按體重隨機分為缺氧預適應組(以下簡稱對照組)和通心絡組，每組40只。每組小鼠分別進行重復缺氧暴露0次(H0)，缺氧1次(H1)，缺氧3次(H3)，缺氧5次(H5)。

2.2 給藥劑量及方法 根據(jù)通心絡超微粉提高小鼠缺氧耐受性的時效、量效關系實驗研究結果［1］，確定通心絡組劑量為 1.52 g 生藥·kg－1·d－1，用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)配制成濃度為:0.152 kg生藥/L混懸液，按0.1 mL/10 g動物體重灌胃?？瞻讓φ战M，按0.1 mL/10 g動物體重用0.5%CMC－Na溶液灌胃。于實驗前5 d開始給藥，末次給藥1 h后實驗，實驗周期為5 d。

2.3 缺氧預適應方法 參照呂國蔚等［2］的方法，在室溫18－22℃下，將小鼠稱質量后放入含有新鮮空氣、經過標定的約120 mL廣口瓶內，以橡皮塞密封、計時，一旦動物出現(xiàn)喘呼吸時(小鼠在缺氧末期出現(xiàn)紫紺，翻正反射消失，痙攣樣動作和喘呼吸，喘呼吸后即呼吸停止)立即取出，并隨即轉移到另一容積相似、含有新鮮空氣的廣口瓶內密閉、記時，如此重復5次。各次換瓶從密閉開始到喘呼吸出現(xiàn)的時間為“原始耐受時間”，以min為單位。

2.4 取材方法 缺氧實驗結束后，動物立即斷頭取血，即刻取腦并于液氮中速凍后于－80℃超低溫冰箱中凍存。

2.5 觀察指標

①標準耐受時間 參照呂國蔚等［3］的方法依下式算出相當于100mL有效空氣量下的“標準耐受時間”T=原始耐受時間 ×100/(120－小鼠體重/0.94)，比較各次的耐受時間。

② Western blotting方法檢測腦組織 HIF－1α、Bax、Bcl－2的蛋白表達 從超低溫冰箱中取出鼠腦，液氮中迅速研磨，加適量裂解液冰上裂解30 min，12000×g離心30 min，取上清液分裝。利用BCA法進行總蛋白定量。加2×上樣緩沖液配制樣本，100℃加熱10 min變性，從上述各組樣品中分別120 μg的蛋白上樣，用12%的 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后，用電轉印儀將凝膠中的蛋白質轉印到硝酸纖維素膜上。將轉印后的膜依次與Ⅰ抗(抗HIF－1α單克隆抗體，1∶1000稀釋;Bax抗體、Bcl－2抗體1∶200稀釋)和Ⅱ抗(與辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG，北京中山生物技術有限公司，1∶10000稀釋);孵育，化學發(fā)光顯影(化學發(fā)光檢測試劑盒，Thermo Scientific產品)。實驗結果采用Quantity One軟件分析，掃描灰度值，以目的蛋白與內參照β－actin的比值表示。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 2組小鼠缺氧標準耐受時間的變化

與第1次缺氧比較，2組小鼠隨著缺氧次數(shù)的增加，缺氧耐受時間明顯增加(P＜0.01或P＜0.05)。與對照組比較，通心絡組各次的缺氧耐受時間明顯增加，差異顯著(P＜0.01或P＜0.05)，見表1。

表1 各組小鼠缺氧耐受時間的變化Table 1.Hypoxic tolerance time of mice in two groups(min..n=10)

表1 各組小鼠缺氧耐受時間的變化Table 1.Hypoxic tolerance time of mice in two groups(min..n=10)

##P＜0.01 vs H1in the same group;△P＜0.05 vs H3in the same group;*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group at the same hypoxia exposure times.H1:hypoxia exposure once;H3:hypoxia exposure 3 times;H5:hypoxia exposure 5 times;control group:hypoxia preconditioning group.TXL:Tongxinluo(a Chinese medicine)group.

Control 15.57 ±2.00 41.69 ±9.04## 51.44 ±14.38##△TXL 18.01 ±2.37* 68.34 ±13.22##＊＊ 85.87 ±6.95##△＊＊

2 2組小鼠HIF－1α表達的變化

2組小鼠在缺氧前腦組織有極少量HIF－1α表達，2組之間無明顯差異(P＞0.05);隨缺氧次數(shù)增加，HIF－1α表達逐漸增強。與缺氧前比較，對照組缺氧1次有增加，但無明顯差異;缺氧3次、缺氧5次明顯增加，差異顯著(P＜0.01或P＜0.05)。通心絡組，缺氧1次、3次、5次HIF－1α表達均比缺氧前明顯增加(P＜0.01或P＜0.05)。與對照組比較，通心絡組各次缺氧HIF－1α表達更加明顯，差異顯著(P＜0.01或P＜0.05)。提示通心絡組較對照組提前刺激機體表達HIF－1α;能夠明顯增加缺氧預適應小鼠HIF－1α的表達，見圖1。

3 2組小鼠Bax的表達變化

缺氧前小鼠腦組織有少量Bax表達，2組之間無明顯差異。通心絡組缺氧1次和3次，對照組缺氧1次、3次和5次Bax表達均比缺氧前增強，而2組缺氧3次和缺氧5次，較缺氧1次明顯減少，差異顯著(P＜0.01或P＜0.05)。與對照組比較，通心絡組各次缺氧小鼠Bax表達明顯減弱，差異顯著(P＜0.01或P＜0.05)。通心絡組5次缺氧時Bax表達與缺氧前比較無明顯差異(P＞0.05)，見圖2。

4 2組小鼠Bcl－2表達變化

2組小鼠在缺氧前腦組織有少量Bcl－2表達，通心絡組Bcl－2表達高于對照組(P＜0.05);隨著缺氧次數(shù)增加，2組Bcl－2表達均逐漸增強，差異顯著(P＜0.01或P＜0.05)。與對照組比較，通心絡組各次缺氧Bcl－2表達更加明顯，差異顯著(P＜0.01或P ＜0.05)，見圖3。

Figure 1.The expression of HIF－1α in cerebral tissues by Western blotting..n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs H0in the same group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group at the same hypoxia exposure times.H0:no hypoxia exposure;H1:hypoxia exposure once;H3:hypoxia exposure 3 times;H5:hypoxia exposure 5 times.control:hypoxia preconditioning group.TXL:Tongxinluo(a Chinese medicine)group.圖1 腦組織HIF－1α表達的變化

Figure 2.The expression of Bax in cerebral tissue of mice by Western blotting..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs H0in the same group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs H1in the same group;△P＜0.05 vs control group at the same hypoxia exposure times.H0:no hypoxia exposure;H1:hypoxia exposure once;H3:hypoxia exposure 3 times;H5:hypoxia exposure 5 times.control:hypoxia preconditioning group.TXL:Tongxinluo(a Chinese medicine)group.圖2 腦組織Bax表達的變化比較

Figure 3.The expression of Bcl－2 in cerebral tissues of mice by Western blotting..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs H0in the same group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs H1in the same group;△P＜0.05 vs control group at the same hypoxia exposure times.H0:no hypoxia exposure;H1:hypoxia exposure once;H3:hypoxia exposure 3 times;H5:hypoxia exposure 5 times.control:hypoxia preconditioning group.TXL:Tongxinluo(a Chinese medicine)group.圖3 腦組織Bcl－2表達的變化比較

討 論

適應是機體在內外環(huán)境的變化中，通過改變自身的機能、形態(tài)和結構以適應其變化，從而更好地生存下去。小鼠的缺氧耐受時間隨缺氧暴露次數(shù)增加而顯著延長［3］。動物整體缺氧耐受時間是衡量缺氧耐受的一個重要指標［4］。本研究結果顯示，隨著缺氧次數(shù)的增加，小鼠耐受缺氧的時間逐次增加。與對照組比較，通心絡干預后，小鼠的耐缺氧時間明顯增加。提示機體對缺氧等刺激具有強大的耐受能力，缺氧預適應小鼠通過自身適應機制可以提高機體的缺氧耐受性，而通心絡能夠提高缺氧預適應小鼠的自適應能力，提高缺氧預適應小鼠的缺氧耐受性。

目前，人類對缺氧所觸發(fā)的機體許多適應和不適應的系統(tǒng)反應認識還很少［5］。1991年首次發(fā)現(xiàn)HIF－1，作為誘導低氧反應基因和修復細胞氧內環(huán)境穩(wěn)定的核心調節(jié)因子及其所誘導的一系列低氧反應效應基因或靶基因的表達，研究發(fā)現(xiàn)HIF－1可以誘導下游靶基因如血管內皮生長因子(VEGF)、Bcl－2等的轉錄，從而產生一系列代償反應，促進細胞的生長和代謝［6］。缺氧誘導HIF－1高表達可顯著減輕缺氧時HepG2細胞的損傷程度［7］。本研究結果顯示:隨著缺氧次數(shù)的增加，腦組織HIF－1α蛋白表達逐次增強。提示缺氧預適應小鼠通過自身的調節(jié)，逐漸達到自身的平衡穩(wěn)態(tài)。而與對照組比較，通心絡組較對照組能夠提前刺激機體表達HIF－1α，能夠明顯增加缺氧預適應小鼠各次缺氧HIF－1α的表達，表明通心絡具有提高機體自調節(jié)能力的作用。

Baranova等［8］研究證實，在缺氧缺血急性期HIF－1α可促進細胞凋亡，但隨后這種損傷作用就被其調節(jié)的靶基因(促紅細胞生成素、VEGF等)的正面作用所取代。內源性VEGF可以上調凋亡相關基因Bcl－2表達，防止毛細血管內皮細胞凋亡，對缺血腦組織可能具有神經保護作用。缺氧預適應可以增強Bcl－2和降低caspase－3的表達［9］。缺氧預適應可以通過穩(wěn)定線粒體膜電位、升高Bcl－2和VEGF，促進ERK和AKT磷酸化，抑制間質干細胞凋亡而對心肌起保護作用［10］。本研究結果顯示:隨著缺氧次數(shù)的增加腦組織Bcl－2蛋白表達逐次增強，Bax蛋白在1次缺氧時明顯增強，在3次、5次缺氧時逐漸降低，提示機體具有自我調節(jié)能力。而與對照組比較，通心絡組各次缺氧腦組織Bcl－2蛋白表達增加，Bax下降，提示通心絡能夠提高機體抗凋亡的作用。

既往多項研究證實通心絡對血管內皮細胞、神經元具有保護作用，而內皮細胞的保護對于心腦血管疾病的防治具有重要意義。本研究結果提示機體通過激發(fā)自身的調節(jié)機制，抑制促凋亡因子的產生，促進抗凋亡因子的表達，使機體逐漸達到自身的平衡穩(wěn)態(tài)。通心絡能夠明顯增強缺氧預適應小鼠腦組織抗凋亡因子的表達，抑制缺氧預適應小鼠腦組織促凋亡因子的表達，調節(jié)細胞凋亡失調的狀態(tài)而達到相對平衡狀態(tài)，從而參與腦保護機制。提示通心絡能通過提高機體的自調節(jié)作用，而提高機體自適應能力。通心絡具有益氣活血、通絡止痛的功效，方中含有人參、全蝎、蜈蚣、水蛭、土鱉蟲、蟬蛻、赤芍、冰片等藥物，現(xiàn)代藥理研究證實通心絡組方中的主要藥物均具有不同程度抗缺氧作用，人參總皂苷可以顯著增強小鼠大腦皮質HIF－1α蛋白表達水平，減輕小鼠大腦皮質的損傷程度，具有顯著的保護作用［11］。人參皂苷Rb1能夠減輕缺氧誘導的細胞損害和海馬神經元損傷程度［12］。水蛭提取物有明顯抑制缺氧誘導的新生大鼠大腦皮層神經細胞凋亡的作用，對大腦皮層神經細胞的缺氧性損傷具有明顯的保護作用［13］。冰片能夠透過血腦屏障，作為引藥能明顯加強川芎嗪的抗急性缺氧作用［14］。通心絡顯著的抗缺氧能力可能是方中藥物綜合作用的體現(xiàn)，為臨床心腦血管疾病的治療提供了實驗依據(jù)。

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