唐敬龍， 高維娟， 李玉明， 錢濤， 張泓波， 李君， 謝志

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000)

大腦對缺血缺氧十分敏感，其中反復(fù)腦缺血再灌注損傷和長期慢性低灌流是引發(fā)血管性癡呆(vascular dementia，VD)的主要原因。而海馬CA1區(qū)被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶等高級神經(jīng)活動(dòng)的重要部位，是腦缺血最敏感的區(qū)域之一，故腦海馬CA1區(qū)常被用來作為缺血缺氧損傷研究的模型［1］。在缺血性腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2(extracellular signal－regulated kinase，ERK2)能調(diào)控海馬神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化，參與海馬神經(jīng)元的可塑性;鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱβ(calcium/calmodulin－dependent protein kinaseⅡβ，CaMKⅡβ)蛋白則參與突觸構(gòu)建過程，增強(qiáng)長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(long－term potentiation，LTP)，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的恢復(fù)。益氣活血中藥補(bǔ)陽還五湯是中醫(yī)治療腦缺血再灌注損傷的經(jīng)典方劑，已經(jīng)證實(shí)其有顯著的抗VD作用［2］，但其分子機(jī)制尚未闡明，本實(shí)驗(yàn)通過觀察補(bǔ)陽還五湯對VD大鼠CA1區(qū)ERK2與CaMKⅡβ蛋白表達(dá)的影響，探討補(bǔ)陽還五湯對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其對海馬神經(jīng)元保護(hù)的分子機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 試劑儀器 補(bǔ)陽還五湯(由黃芪、當(dāng)歸尾、芍藥、川芎、桃仁、紅花、地龍組成 )由北京同仁堂醫(yī)藥公司承德分公司提供;戊巴比妥鈉為進(jìn)口分裝;兔來源ERK2、兔來源CaMKⅡβ購自Cell Signaling Technology;兔來源β－actin購自Santa Cruz Biotechnology;羊抗兔IgG購自Proteintech;發(fā)光液購自Thermo;Morris水迷宮(Morris Water Maze，MWM)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 成年SD雄性大鼠60只，體重220g±20g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號為SCXK(京)2007－0001，SPF級。通過水迷宮試驗(yàn)篩選出智力水平相當(dāng)?shù)拇笫?，并隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組和尼莫地平組(陽性藥物對照)，每組15只。

2 方法

2.1 VD動(dòng)物模型制備 采用改良的Pulsinelli’s 4血管阻斷 (four－vessel occlusion，4VO)方法制備VD動(dòng)物模型［3］:大鼠于術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，戊巴比妥鈉(45－50 mg/kg)腹腔注射麻醉。將大鼠伏臥固定于固定臺上，行背側(cè)頸正中切口，逐層鈍性分離暴露雙側(cè)第1頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞。24 h后再將大鼠麻醉，仰臥固定，行腹側(cè)頸正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，以“4”號絲線穿線牽拉頸總動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5 min，共夾閉3次，每次間隔1 h。假手術(shù)組只做皮膚切口和組織分離處理，不進(jìn)行椎動(dòng)脈燒灼和頸總動(dòng)脈夾閉，皮膚縫合后正常飼養(yǎng)。模型組大鼠造模后自然飼養(yǎng);補(bǔ)陽還五湯組和尼莫地平組大鼠按上述方法造模后分別灌服補(bǔ)陽還五湯(50 g·kg－1·d－1)和尼莫地平(20 mg·kg－1·d－1)，持續(xù)灌服 30 d。

2.2 大鼠行為學(xué)檢測 采用Morris水迷宮法進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的測定。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation)分別在術(shù)后7 d、14 d、28 d將大鼠從標(biāo)記的4個(gè)入水點(diǎn)依次朝向池壁輕輕放入水中，記錄其在90 s內(nèi)尋找到并爬上平臺的搜索持續(xù)時(shí)間即逃避潛伏期(escape latency，EL)。若大鼠90s內(nèi)尚未找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺停留15 s，放回籠中。取3 d的平均成績作為測試的成績。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)(space navigation)定位航行結(jié)束后撤除平臺，讓大鼠在水池中游90 s來尋找平臺，記錄大鼠90 s內(nèi)跨越平臺次數(shù)，取3 d的平均成績作為測試的成績。

2.3 取材、固定、HE染色 術(shù)后第30 d，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取5只大鼠用戊巴比妥鈉(45－50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后仰臥固定，快速開胸，暴露心臟，直視下左心室插管入升主動(dòng)脈，剪開右心耳，以生理鹽水約500 mL經(jīng)升主動(dòng)脈灌注沖洗后，再灌注4%多聚甲醛溶液(pH7.4)500 mL，持續(xù)2 h后開顱取腦，并將腦組織置于4℃4%多聚甲醛中浸置4－6 h后，截取視交叉至大腦橫裂的部分，PBS漂洗3次，每次1 h，4℃冰箱過夜，將固定好的腦組織予以常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚4 μm，用于HE染色。染色方法:石蠟切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)逐級乙醇脫水后，蘇木素、伊紅染色，中性樹膠封片。

2.4 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元計(jì)數(shù) HE切片采用Mivnt圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行拍照。顯微鏡觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元并進(jìn)行計(jì)數(shù)，每張切片選6個(gè)不同子午線方向視野行各層細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其平均值。

2.5 ERK2與CaMKⅡβ蛋白的檢測 術(shù)后第30 d，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取10只大鼠用戊巴比妥鈉(45－50 mg/kg)麻醉，取海馬放入液氮，于立體鏡下切除CA1之后轉(zhuǎn)存到－70℃冰箱中。待所有標(biāo)本收集完畢后將樣品立即放到4℃預(yù)冷的勻漿器中，先用PBS勻漿至清澈，棄上清，加裂解緩沖液中，裂解40 min。之后12000 r/min離心15 min取上清液分裝。用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。將提取蛋白樣品加入等體積的2×loading buffer混勻，在100℃沸水中煮3 min，變性，－80℃保存，備用。以12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，ERK2蛋白按每孔蛋白上樣量為30 μg，CaMKⅡβ蛋白按每孔蛋白上樣量為50 μg按積層膠80 V，分離膠120 V條件(恒壓)進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)移動(dòng)至膠底部終止電泳。轉(zhuǎn)膜前先用甲醇激活PVDF膜(1 min)，按陰極近膠、陽極近膜的位置準(zhǔn)備好轉(zhuǎn)膜裝置，4℃條件下300 mA(恒流)轉(zhuǎn)膜2.5 h，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%TBST脫脂奶粉封閉液封閉PVDF膜2 h，后加入兔抗ERK2多克隆抗體(1∶1000稀釋)、CaMKⅡβ多克隆抗體(1∶1000稀釋)、β －actin(1∶600稀釋)4℃ 過夜。TBST洗3次，15 min×1次，10 min×2次，Ⅱ抗用生物素標(biāo)記羊抗兔 IgG(1∶2000稀釋)孵育1 h，TBST洗3次，5 min×3次，經(jīng)ECL發(fā)光試劑盒顯影，X射線底片曝光。以β－actin為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。將蛋白印跡顯影圖像掃描。用Quantity One分析軟件進(jìn)行半定量分析，將ERK2與CaMKⅡβ蛋白灰度值與內(nèi)參照β－actin灰度值比較，所得比值表示各組樣品ERK2與CaMKⅡβ蛋白的表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 補(bǔ)陽還五湯對大鼠水迷宮逃避潛伏期的影響

假手術(shù)組大鼠在術(shù)后7 d、14 d、28 d的逃逸潛伏期分別為(26.65±1.23)s、(12.96 ±1.13)s、(8.44±1.10)s;與之比較，模型組大鼠在各個(gè)時(shí)點(diǎn)的逃逸潛伏期［(63.57 ±2.14)s、(59.45 ±2.01)s、(54.25 ±1.83)s］均明顯延長(P＜0.05);與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯組［(38.62 ±2.07)s、(21.36 ±1.23)s、(12.91±1.31)s］和尼莫地平組［(40.11 ±2.04)s、(22.58 ±1.65)s、(13.63 ±1.46)s］在術(shù)后第 7 d、14 d、28 d逃避潛伏期均顯著縮短(P＜0.05);補(bǔ)陽還五湯組和尼莫地平組相比，大鼠在術(shù)后各個(gè)時(shí)點(diǎn)逃避潛伏期均無明顯區(qū)別(P＞0.05)，見圖1。

Figure 1.The effect of Buyinghuanwu decoction on the escape latency of rats in Morris water maze at different time points..n=15.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs VD group.圖1 補(bǔ)陽還五湯對大鼠水迷宮逃避潛伏期的影響

2 補(bǔ)陽還五湯對大鼠水迷宮跨越平臺次數(shù)的影響

假手術(shù)組大鼠在術(shù)后第7 d、14 d、28 d跨越平臺次數(shù)在90s內(nèi)分別為(7.94±0.72)次、(12.83±0.80)次、(15.89±0.82)次;與之相比，模型組大鼠在各個(gè)時(shí)點(diǎn)的跨越平臺次數(shù)［(3.13±0.28)次、(5.62±0.33)次、(6.33±0.48)次］均顯著減少(P＜0.05);與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯組［(6.75±0.61)次、(11.55±0.69)次、(14.92±0.72)次］和尼莫地平組［(6.42±0.58)次、(10.63±0.69)次、(13.71±0.70)次］在術(shù)后第 7 d、14 d、28 d跨越平臺次數(shù)均顯著增多(P＜0.05);補(bǔ)陽還五湯組和尼莫地平組相比，大鼠在術(shù)后各個(gè)時(shí)點(diǎn)跨越平臺次數(shù)均無明顯區(qū)別(P＞0.05)，見圖2。

Figure 2.The effect of Buyanghuanwu decoction on times of striding over platform of rats in Morris water maze at different time points..n=15.*P＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs VD group.圖2 補(bǔ)陽還五湯對大鼠水迷宮跨越平臺次數(shù)的影響

3 補(bǔ)陽還五湯對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響

術(shù)后30d，假手術(shù)組表現(xiàn)為正常組織形態(tài)，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，均勻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，見圖3A;而模型組CA1區(qū)海馬神經(jīng)細(xì)胞排列欠規(guī)則，界限不清楚，正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，胞核區(qū)域濃染，出現(xiàn)凝固性壞死，細(xì)胞脫失明顯，見圖3B;補(bǔ)陽還五湯組及尼莫地平組大部分海馬神經(jīng)元細(xì)胞接近正常，核膜輪廓清晰，核仁清楚，排列規(guī)則，見圖3C、D。

Figure 3.The effect of Buyanghuanwu decoction on morphological changes in hippocampal CA1 of rats 30 d after operation(×400).A:sham group，the neurons were in neat rows，integral structure;B:model group，cells showed irregular arrangement，coagulation necrosis and obvious deletion;C:VD+Buyanghuanwu decoction group，the neurons were in neat rows，integral structure and close to those in sham group;D:VD+nimodipine group，the neurons were in neat rows，integral structure and close to those in sham group.圖3 術(shù)后30 d補(bǔ)陽還五湯對大鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)的影響

4 補(bǔ)陽還五湯對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目的影響

術(shù)后30 d，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示:與假手術(shù)組(48.56±3.23)比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目(16.33±1.08)明顯減少(P＜0.05);補(bǔ)陽還五湯組(45.92±3.06)和尼莫地平組(43.19±2.87)大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目明顯多于模型組(P＜0.05);補(bǔ)陽還五湯組與尼莫地平組比較無明顯差別(P＞0.05)，見圖4。

5 補(bǔ)陽還五湯對大鼠海馬組織神經(jīng)元胞漿蛋白ERK2表達(dá)的影響

術(shù)后30 d，對蛋白條帶平均灰度值進(jìn)行分析結(jié)果顯示:與假手術(shù)組(1.01±0.09)比較，模型組(0.53±0.07)大鼠海馬ERK2蛋白在術(shù)后28 d表達(dá)顯著減少(P＜0.05)，而補(bǔ)陽還五湯組(0.99±0.08)和尼莫地平組(0.93±0.08)ERK2蛋白的表達(dá)則明顯高于模型組(P＜0.05)，且補(bǔ)陽還五湯組和尼莫地平組相比，蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，見圖5。

Figure 4.The effect of Buyanghuanwu decoction on the numbers of hippocampal CA1 neurons of rats 30 d after operation..n=5.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs VD group.圖4 術(shù)后30 d補(bǔ)陽還五湯對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目的影響

Figure 5.The effect of Buyanghuanwu decoction on the expression of ERK2 in hippocampal CA1 neurons of rats 30 d after operation.A:VD group;B:VD+nimodipine group;C:VD+Buyanghuanwu decoction;D:sham group..n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs VD group.圖5 術(shù)后30 d補(bǔ)陽還五湯對大鼠海馬組織神經(jīng)元ERK2蛋白表達(dá)的影響

6 補(bǔ)陽還五湯對大鼠海馬組織神經(jīng)元CaMKⅡβ蛋白表達(dá)的影響

術(shù)后30 d，對蛋白條帶平均灰度值進(jìn)行分析結(jié)果顯示:與假手術(shù)組(1.12±0.04)比較，模型組(0.56±0.03)大鼠海馬CaMKⅡβ蛋白在術(shù)后28 d表達(dá)顯著減少(P＜0.05)，而補(bǔ)陽還五湯組(1.01±0.04)和尼莫地平組(1.00±0.05)CaMKⅡβ蛋白的表達(dá)則明顯高于模型組(P＜0.05)，補(bǔ)陽還五湯組和尼莫地平組相比，CaMKⅡβ蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，見圖6。

討 論

VD是由腦血管疾病所致的智能及認(rèn)知功能障礙臨床綜合征。最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷、學(xué)習(xí)記憶能力下降。ERK2是細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的生長、分化和損傷修復(fù)［4］，保護(hù)受損神經(jīng)元。VD還與CaMKⅡβ密切相關(guān)，Okamoto等［5］發(fā)現(xiàn) CaMKⅡβ亞基的285－542和344－542氨基酸位點(diǎn)突變導(dǎo)致其蛋白激酶活性喪失，從而影響信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，造成突觸構(gòu)建障礙。

Figure 6.The effect of Buyanghuanwu decoction on the expression of CaMKⅡβ in hippocampal CA1 neurons of rats 30 d after operation.A:VD group;B:VD+nimodipine group:C:VD+Buyanghuanwu decoction;D:sham group..n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs VD group.圖6 術(shù)后30 d補(bǔ)陽還五湯對大鼠海馬組織神經(jīng)元CaMKⅡβ蛋白表達(dá)的影響

近年來，國內(nèi)進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)益氣活血中藥有顯著的抗VD作用［6－9］。而補(bǔ)陽還五湯是益氣活血中藥中的經(jīng)典方劑，由黃芪、當(dāng)歸尾、芍藥、川芎、桃仁、紅花、地龍組成，本方重用黃芪，補(bǔ)益元?dú)?，瘀去絡(luò)通，為君藥。實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃芪有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等作用［10］。當(dāng)歸尾活血通絡(luò)而不傷血，用為臣藥。赤芍、川芎、桃仁、紅花協(xié)同當(dāng)歸尾以活血化瘀，地龍通經(jīng)活絡(luò)，力專善走，周行全身，以行藥力，亦為佐藥［11］。此外補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后明顯減低VD大鼠鈣離子通道的開放時(shí)間和開放率［12］，減輕鈣超載對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，改善微循環(huán)。尼莫地平是二氫吡啶類鈣離子通道阻滯劑，有解除腦血管痙攣，改善微循環(huán)等作用。臨床上可用于治療輕重度VD［13］。本實(shí)驗(yàn)以尼莫地平為陽性對照藥物。

本實(shí)驗(yàn)給予補(bǔ)陽還五湯干預(yù)治療后，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示:隨時(shí)間的延長各組大鼠的EL均有不同程度的縮短，垮臺次數(shù)有不同程度的增多，這與水迷宮訓(xùn)練次數(shù)的增加促進(jìn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶有關(guān)系。但是假手術(shù)組大鼠的EL縮短和跨越平臺次數(shù)增多較模型組顯著，表明正常大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能較模型組好。此外，VD大鼠的EL縮短幅度與垮臺次數(shù)增加幅度小，表明其學(xué)習(xí)記憶能力隨時(shí)間的延長而降低，提示腦損害逐漸加重。HE染色及細(xì)胞計(jì)數(shù)均證實(shí)，補(bǔ)陽還五湯對VD大鼠的缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，改善學(xué)習(xí)記憶。Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)，模型組大鼠海馬CA1區(qū)ERK2蛋白表達(dá)下調(diào)，使ERK2與下游轉(zhuǎn)錄因子(如CREB)結(jié)合能力下降，影響下游基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、合成等水平，使ERK2蛋白總量減少，導(dǎo)致受損細(xì)胞因不能被修復(fù)而死亡［4］。CaMKⅡβ蛋白表達(dá)下調(diào)，降低AMPA受體的電導(dǎo)作用，使LTP難以維持［14］，同時(shí)CaMKⅡβ向突觸后膜移動(dòng)減少，使突觸構(gòu)建能力下降，無法激活細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)及新突觸的形成［15］，從而使PSD間隙變寬，信息傳遞時(shí)間延長，減弱學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，應(yīng)用促進(jìn)ERK2與CaMKⅡβ蛋白表達(dá)的藥物可能成為治療VD的有效方法之一。本實(shí)驗(yàn)給予補(bǔ)陽還五湯治療30 d后能顯著上調(diào)ERK2與CaMKⅡβ蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，顯著改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，這為治療血管性癡呆提供了新選擇。

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