陳兆國(guó)，米榮升，于慧珠，郝言明，胡義彬，黃 燕，李正鋒，李 艷，林矯矯

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/上海動(dòng)物生物技術(shù)研究中心，上海200241)

雞球蟲病是由艾美耳屬(Eimeria)球蟲引起的一種寄生蟲病，嚴(yán)重危害雞的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)雛雞的危害尤為嚴(yán)重。雞球蟲分為：堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)、布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)、和緩艾美耳球蟲(E.mitis)、毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)、早熟艾美耳球蟲(E.praecox)和柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)7種。其中E.praecox是一種“早熟型”球蟲，卵囊相對(duì)較大，最短孢子化時(shí)間為12 h，最短潛在期為83 h。由于該蟲種對(duì)雞的致病性較弱，因而對(duì)其研究較少。由于雞球蟲病多為球蟲混合感染引起，并且感染率高，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成的損失巨大，因此愈來愈受到人們的關(guān)注。

本研究對(duì)上海田間球蟲混合樣品進(jìn)行分離和鑒定，為豐富我國(guó)雞球蟲蟲種資源，發(fā)展球蟲病防治技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 球蟲樣品和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 含E.praecox卵囊的多個(gè)艾美耳球蟲蟲種，分離自上海郊區(qū)某雞場(chǎng)，經(jīng)雞傳代后收集卵囊，孢子化后4℃保存?zhèn)溆?；黃羽肉雞購自上海郊區(qū)某大型雞場(chǎng)。

1.2 菌株和載體E.coliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T載體購自TaKaRa公司。

1.3 主要試劑 TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、ExTaq酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ均購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；100 bp DNA Ladder購自北京天根生化科技有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Schnitzler等報(bào)道設(shè)計(jì)雞球蟲蟲種鑒定引物[4-5](表1)。根據(jù)Barta等報(bào)道設(shè)計(jì)雞球蟲18S rRNA鑒定引物[6]，上游引物ERIB1：5'-ACC TGGTTGATCCTGCCAG-3'，下游引物ERIB10：5'-C TTCCGCAGGTTCACCTACGG-3'。由上海桑尼生物技術(shù)有限公司合成。

表1 雞球蟲蟲種鑒定引物Table 1 Primers used forEimeriaspecies identification

1.5E.preacox單一蟲株的分離

1.5.1 預(yù)分離 收集、純化球蟲樣品，經(jīng)嗉囊感染14日齡黃羽肉雞10羽，每羽感染5×104個(gè)孢子化卵囊。感染后80 h～92 h收集糞便，按常規(guī)方法收集卵囊，加入2.5%重鉻酸鉀水溶液，培養(yǎng)至孢子化卵囊達(dá)80%以上，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 單卵囊分離 按文獻(xiàn)[7]方法感染單卵囊，共感染雛雞15羽。感染后5 d(DPI)開始逐只檢查雞糞中是否含有球蟲卵囊，7DPI剖殺陽性雞，取小腸前1/3部分內(nèi)容物鏡下觀察，收集卵囊，28℃培養(yǎng)至孢子化。

1.6 生物學(xué)性狀檢測(cè) 取1.5.2培養(yǎng)的孢子化卵囊，感染無球蟲雛雞，從感染后76 h起，每小時(shí)收集糞便并檢查是否有卵囊排出，至發(fā)現(xiàn)卵囊止；7DPI剖殺，檢查腸道卵囊寄生部位；收集腸道卵囊進(jìn)行孢子化培養(yǎng)，觀察最短孢子化時(shí)間；觀察孢子化和未孢子化卵囊的形態(tài)。

1.7 單一蟲株的蟲種鑒定

1.7.1 蟲種的初步確定 根據(jù)卵囊形態(tài)大小、最短潛在期、寄生部位和最短孢子化時(shí)間等結(jié)果，參考文獻(xiàn)，初步確定蟲種。

1.7.2 蟲種PCR鑒定 取105個(gè)經(jīng)飽和鹽水漂浮法純化的孢子化卵囊，勻漿破碎，按TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒說明書操作提取蟲體基因組DNA。以基因組DNA為模板，用表1中7對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃2 min；95℃30 s、62℃30 s、72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

1.8 18S rRNA基因的擴(kuò)增和序列測(cè)定

1.8.1 PCR擴(kuò)增 以基因組DNA為模板，應(yīng)用18S rRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.8.2 擴(kuò)增片段的克隆及篩選 應(yīng)用V-gene DNA凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行回收并純化，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，采用藍(lán)白斑篩選陽性菌落，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，篩選陽性克隆。

1.8.3 序列測(cè)定和分析 陽性重組質(zhì)粒由上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。利用DNAStar及Mega 4.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)和分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.9 單一蟲株的致病性觀察 選取1個(gè)單一蟲株進(jìn)行致病性試驗(yàn)。將體質(zhì)量相近的14日齡雛雞60羽，平均分為 6組，經(jīng)嗉囊接種 0、1×104、5×104、1×105、2×105、4×105個(gè)孢子化卵囊。7DPI稱重、剖殺，觀察各組實(shí)驗(yàn)雞的增重、飼料轉(zhuǎn)化率和腸道病變。

1.10 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 12.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 單卵囊分離結(jié)果 對(duì)糞便和小腸內(nèi)容物進(jìn)行檢查，單卵囊接種的15羽雛雞中，有5羽感染，單卵囊接種感染率為33.3%。收集編號(hào)為EPSH的單一蟲株的卵囊進(jìn)行重新接種、蟲種鑒定和生物學(xué)性狀測(cè)定。

2.2 EPSH的生物學(xué)性狀測(cè)定

2.2.1 卵囊形態(tài) 卵囊多數(shù)呈橢圓形，少數(shù)呈卵圓形或球形，壁光滑，無卵膜孔；經(jīng)孢子化的卵囊內(nèi)有一極粒，無卵囊殘?bào)w，無孢子囊殘?bào)w。

隨機(jī)測(cè)定從腸道、糞便收集的未孢子化和孢子化卵囊各 50個(gè)，大小為 15.00 μm～25.00 μm×13.75 μm～22.5 μm，平均大小為 20.07 μm×17.52 μm，形狀指數(shù)(shape index，SI)為1.15，具體見表2。

表2 ETSH株球蟲卵囊大小Table 2 Oocysts size of ETSH

最小顯著差數(shù)法(Least-significant difference，LSD)檢驗(yàn)分析顯示，收集于腸道的EPSH株孢子化卵囊與未孢子化卵囊長(zhǎng)和寬的顯著性(Sig)分別為0.137和0.071，p>0.05，無顯著差異；但收集于腸道的卵囊與收集于糞便的卵囊比較，Sig均為0，p<0.01，差異極顯著；收集于糞便的未孢子化卵囊分別與孢子化卵囊的長(zhǎng)和寬比較，其中長(zhǎng)度的Sig為 0.020，p<0.05，差異顯著；寬度的 Sig為 0，p<0.01，差異極顯著(表 2)。用 Studednt-Newman-Keuls和Duncan法檢驗(yàn)，結(jié)果與LSD法一致。

2.2.2 寄生部位 EPSH株寄生于小腸前1/3部位，主要寄生于十二指腸。

2.2.3 最短孢子化時(shí)間 經(jīng)2次以上重復(fù)檢查，結(jié)果顯示EPSH株腸道收集到卵囊的最短孢子化時(shí)間為16 h。

2.2.4 最短潛在期 將收集的卵囊接種無球蟲雛雞，觀察結(jié)果顯示最短潛在期為81 h。

2.3 蟲種PCR鑒定 EPSH株卵囊基因組DNA經(jīng)7對(duì)引物分別擴(kuò)增后，僅引物EPA/EPR擴(kuò)增出約400 bp的片段(圖1)，表明該蟲株為E.praecox，命名為E.praecox上海株。

2.4 18S rRNA基因的克隆和系統(tǒng)發(fā)生分析 ETSH株球蟲18S rRNA基因擴(kuò)增片段大小約為1 700 bp。將PCR產(chǎn)物連接于pMD18-T載體中，PCR及酶切鑒定結(jié)果均正確。序列測(cè)定結(jié)果表明EPSH株18S rRNA基因序列長(zhǎng)1 747 bp，與GenBank登錄的E.praecox18S rRNA基因序列(U67120)同源性為 99.4%(表3)。與E.acervulina、E.brunetti、E.maxima、E.mitis、E.necatrix和E.tenella18S rRNA序列(登錄號(hào)分別為 U67115、U67116、U67117、U67118、U67119 和U67121)同源性分別為97.7%、96.4%、96.7%、94.5%、95.0%和95.5%。已將該序列錄入Gen-Bank，登錄號(hào)為GQ421692。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示上海田間分離的EPSH株與GenBank登陸的E.praecox在同一個(gè)分支上，與E.mitis、E.brunetti和E.maxima的遺傳距離相對(duì)較近，但E.acervulina、E.necatrix和E.tenella的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)(圖2)。

2.5 致病性 以不同劑量的EPSH株球蟲接種雛雞，均未死亡。但隨著接種劑量的增加，雛雞相對(duì)增重率逐漸下降，而料肉比呈逐漸上升趨勢(shì)(表3)。感染雞病變僅局限于十二指腸，主要表現(xiàn)為腸管壁有少量粘液，并有針尖狀出血點(diǎn)，而空腸未見眼觀病變。其中 1×104、5×104、1×105、2×105和 4×105劑量接種組分別有4羽、4羽、5羽、6羽和5羽出現(xiàn)上述癥狀。

從排卵囊情況分析，各組均在4 DPI開始排出卵囊，其中1×104感染組在5 DPI達(dá)到排卵囊峰值，此后逐漸下降。其余4組均在6 DPI達(dá)到排卵囊峰值，7 DPI則明顯下降(圖3)。

表3 ETSH株球蟲卵囊大小Table 3 Oocysts size of ETSH

3 討 論

本研究利用單卵囊分離技術(shù)從上海田間混合樣品中分離獲得5個(gè)雞艾美耳球蟲單一純化株，通過卵囊形態(tài)大小、最短孢子化時(shí)間、最短潛在期和寄生部位等生物學(xué)特性觀察及PCR鑒定，確定編號(hào)為EPSH的單一蟲株為E.praecox，命名為E.praecox上海株。

卵囊的量度可以作為球蟲的一種特征，但不同的研究者報(bào)道的E.praecox也存在細(xì)微的差異，而且多為孢子化卵囊的報(bào)道，其中，Johnson和Gore等報(bào)道卵囊的平均大小為 23.00 μm～23.80 μm×19.50 μm～20.6 μm，SI為 1.16～1.17[1,8]；Tyzzer和Edgar等報(bào)道卵囊的平均大小為21.25 μm～21.30 μm×17.07 μm～17.10 μm，SI為 1.24～1.25[1,9]；Long和Jorgensen等報(bào)道卵囊的平均大小為20.40 μm～20.60 μm×16.94 μm～17.10 μm，SI為 1.19～1.25[10,11]；徐衛(wèi)東等分離的E.praecox長(zhǎng)春株大小為19.43 μm×15.98 μm，SI為 1.11～1.38，平均為 1.22[2]。而未孢子化卵囊的大小報(bào)道較少。本研究證實(shí)不同來源的E.praecox卵囊大小存在差異，收集自腸道的卵囊明顯小于收集自糞便的卵囊；收集自糞便的未孢子化卵囊與孢子化卵囊的大小也有明顯差異。造成這種現(xiàn)象的原因目前尚不清楚，推測(cè)可能與卵囊所處環(huán)境有關(guān)，在腸道內(nèi)，受宿主內(nèi)環(huán)境包括溫度、濕度、酸堿度和壓力等理化因素、蛋白酶等生物因素的影響，使卵囊處于相對(duì)收縮狀態(tài)；排出體外后，上述因素相對(duì)減輕或發(fā)生變化，卵囊也處于相對(duì)舒展的狀態(tài)，具體原因需要進(jìn)一步研究。

關(guān)于E.praecox的最短潛在期，文獻(xiàn)報(bào)道多為83 h～84 h[1,8-10,12]，而Jorgensen等報(bào)道為92 h[11]，徐衛(wèi)東等報(bào)道為89 h[2]。本研究分離的E.praecox的最短潛在期僅為81 h，比上述報(bào)道至少提前2 h，其原因尚不清楚，推測(cè)可能是特定地理環(huán)境造成的。而蟲株最短孢子化時(shí)間為16 h，比Edgar等的報(bào)道晚4 h[9]，早于徐衛(wèi)東等報(bào)道的20 h[2]和Norton報(bào)道的21 h[13]，這可能與培養(yǎng)溫度、重鉻酸鉀溶液的添加量和雜質(zhì)數(shù)量等因素有關(guān)。但其最短孢子化時(shí)間仍比除E.mitis(15 h)外的其他雞球蟲的時(shí)間要短[14]。孢子化速度通常被引證為球蟲種的特征，在相同條件下，作為一個(gè)特征對(duì)兩種球蟲卵囊的比較，結(jié)果是比較可信的，但測(cè)量方法應(yīng)盡量標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)于E.pracecox的致病性，文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究顯示，E.pracecox上海株感染雛雞后，部分雛雞腸道出現(xiàn)少量粘液，并有針尖狀出血點(diǎn)，但病變位置僅在十二指腸。隨著感染劑量的增加，出現(xiàn)病變的雛雞數(shù)相應(yīng)增加，雞只的相對(duì)增重逐漸下降，而飼料轉(zhuǎn)化率則呈遞增趨勢(shì)，表明雛雞的病變情況與E.pracecox的感染劑量呈正相關(guān)，對(duì)增重及飼料轉(zhuǎn)化率有較大的影響，同時(shí)影響?zhàn)B雞業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，應(yīng)該引起重視。

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