張文龍，殷吉吉，吳東來*，王君偉

(1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室/獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150001)

茨城病(Ibaraki disease，IBAD)是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的流行性出血熱病毒群的茨城病病毒(Ibaraki virus，IBAV)引起的牛急性、熱性傳染病。該病曾在東南亞、澳洲和美洲地區(qū)多次暴發(fā)，給養(yǎng)牛業(yè)造成了一定的經(jīng)濟損失。我國的《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》中將其列為二類傳染病。

目前，IBAV的血清學檢測方法主要是中和試驗、血凝抑制試驗和瓊脂免疫擴散試驗。但以上方法存在耗時多、敏感性較低等不足。因此，需要建立一種簡捷、敏感性高的血清學檢測新方法。

IBAV的VP7蛋白是構成內(nèi)層衣殼的蛋白之一，由病毒的S7基因節(jié)段編碼，全長352個氨基酸[1]，分子量38 ku[1]。VP7蛋白高度保守，屬群特異性抗原[2]。這種保守性使得VP7蛋白在病毒感染的血清學診斷方面受到關注[3-5]。VP7蛋白單體分為上、下兩個結(jié)構域。上層結(jié)構域較小，由多肽鏈的中央1/3區(qū)域構成(121 aa～249 aa)，這一結(jié)構域位于核心顆粒的最外層，在成熟的病毒粒子中與外層衣殼相互作用。該區(qū)域親水性和抗原性較強。本研究對IBAV No.2株的VP7蛋白中抗原性、親水性較強的部分(102 aa～293 aa)進行了截短表達，獲得了可溶性且抗原性良好的截短VP7蛋白，并利用純化的截短VP7蛋白作為包被抗原建立了IBAV抗體間接ELISA檢測方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細胞、菌種和質(zhì)粒 IBAV No.2株、BHK-21細胞系以及大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞和pET-32a(+)載體質(zhì)粒由哈爾濱獸醫(yī)研究所人畜共患病課題組、分子免疫學研究室(以下簡稱本實驗室)保存。含有IBAV No.2株全長S7基因的pET28S7質(zhì)粒由本實驗室構建并保存。

1.2 主要試劑和血清 各種限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、DNA連接試劑盒、DNA分子量Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收小量試劑盒購自上海華舜；蛋白質(zhì)分子量Marker購自Fermentas公司；辣根過氧化物酶標記兔抗牛IgG購自SIGMA公司；鎳離子親和樹脂購自NOVAGEN公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司。IBAV標準陽性、陰性血清由日本農(nóng)林水產(chǎn)省動物衛(wèi)生研究所惠贈；牛結(jié)核、病毒性腹瀉、傳染性鼻氣管炎和口蹄疫陽性血清由本室保存；95份采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)和70份采集自云南省的牛血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所辛九慶副研究員惠贈。

1.3 截短S7基因重組表達質(zhì)粒的構建 采用引物IBAVS7 shortup：5'-CCGGAATTCATGGAATCAGC-gAATGAGATTG-3'(含有EcoRⅠ酶切位點)和IBAVS7 shortlow：5'-CCGCTCGAGTTATATTGGTGGGATAT TATTCG-3'(含有XhoⅠ酶切位點)。以pET28S7重組質(zhì)粒為模板擴增S7基因307 bp～894 bp(編碼102 aa～293 aa)部分。擴增產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切處理后插入pET-32a(+)質(zhì)粒中。經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET32S-S7，由上海英駿生物技術有限公司進行測序。

1.4 重組蛋白的誘導表達、純化及鑒定 pET32S-S7質(zhì)粒及pET-32a(+)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞。16℃IPTG誘導過夜。

按照Novagen公司His·BindRKits User Protocol TB054 Rev.F 0106所述步驟純化截短VP7重組蛋白。用SDS-PAGE及western blot方法對純化的截短VP7重組蛋白進行鑒定。

按照Bradford試劑盒說明書測定純化截短VP7蛋白的濃度。在蛋白溶液中加入終濃度為50%的滅菌甘油，-20℃保存。

1.5 間接ELISA檢測方法的建立

1.5.1 抗原及一抗工作濃度的確定 將純化的截短VP7蛋白用0.05 M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋，包被96孔酶標板，每孔100 μL。4℃濕盒包被過夜。200 μL 1%明膠封閉，37℃溫箱中孵育 45 min。IBAV陽性血清、陰性血清分別倍比稀釋，每孔100μL進行ELISA方陣試驗。HRP標記的兔抗牛IgG抗體1∶8 000稀釋，每孔100 μL，37℃溫箱中孵育45 min。加入50 μL顯色底物，37℃避光顯色10 min。50 μL 2 mol/L H2SO4中止反應。測定各孔OD492nm值，確定抗原和一抗工作濃度。

1.5.2 包被條件的確定 按照1.5.1所述步驟，選擇3種包被條件進行試驗：-37℃濕盒溫育2 h、4℃濕盒過夜和室溫濕盒過夜。

1.5.3 封閉液的選擇 按照1.5.1所述步驟分別選擇1%明膠、3%明膠、1%BSA、3%BSA、5%脫脂乳和1%酪蛋白作為封閉液進行試驗。

1.5.4 二抗工作濃度的確定 按照1.5.1所述步驟選擇二抗分別以 1∶5 000、1∶8 000 和 1∶10 000 倍比稀釋進行試驗。

1.5.5 ELISA判定標準的確定 按確定的ELISA操作方法檢測25份陰性血清(經(jīng)中和試驗檢測確認)，根據(jù)各陰性血清OD492nm值的平均值(X)和標準差(SD)建立判定標準。取X+3×SD為臨界值。

1.5.6 交叉反應性試驗 用建立的間接ELISA方法檢測?？谔阋卟《?FMDV)、牛病毒性腹瀉病病毒(BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)和牛結(jié)核4種常見牛病的陽性血清。每種血清重復4孔。

1.5.7 競爭性抑制試驗 在IBAV標準陰、陽性血清稀釋液中加入含有IBAV的細胞培養(yǎng)液，37℃作用1 h后進行ELISA檢測。

1.5.8 符合率試驗 用建立的間接ELISA方法檢測95份采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)的血清樣本。同時，用這些血清進行病毒血清中和試驗(SN)，逐日觀察并記錄病變情況。根據(jù)Reed-Muench法計算抗體中和效價，以中和抗體效價≥2為血清抗體陽性。將ELISA試驗結(jié)果與相應的中和試驗結(jié)果進行比較，計算符合率。

1.5.9 臨床樣品檢測 用建立的間接ELISA方法對來自云南省的70份血清樣品進行檢測。測定結(jié)果根據(jù)判定標準確定樣品的陰、陽性，并計算血清樣本的陽性率。

2 結(jié) 果

2.1 pET32S-S7重組質(zhì)粒的鑒定 用EcoRⅠ和XhoⅠ對pET32S-S7重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，獲得約600 bp和 5 300 bp兩條帶，用 IBAV S7 shortup、IBAV S7 shortlow引物對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定獲得約600 bp的特異片段(圖1)；測序結(jié)果證明基因序列正確，表明獲得了正確的重組質(zhì)粒。

2.2 重組蛋白的鑒定 經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，菌體裂解上清中約40 ku處出現(xiàn)一條帶，與預期的截短VP7大小相符。純化后電泳顯示僅在該位置獲得一條蛋白質(zhì)條帶(圖2)。Western blot分析結(jié)果顯示在相應的位置有反應條帶，表明該蛋白條帶是截短VP7蛋白并且具有抗原性(圖3)。

2.3 純化重組蛋白濃度的測定 截短VP7純化蛋白液的OD595nm值為0.0623，根據(jù)標準曲線和標準方程計算蛋白濃度為0.0188 mg/mL。

2.4 工作條件的確定

2.4.1 抗原濃度和一抗工作濃度的確定 以截短VP7蛋白作為包被抗原進行間接ELISA試驗，陽性血清反應與陰性對照區(qū)分均比較明顯(表1)。當抗原包被量為40 ng和50 ng，血清稀釋度為1∶200時，陽性值接近1.0。但包被量為50 ng時OD492nm的P/N值比包被40 ng時大，所以選擇抗原包被量為50 ng，血清稀釋度為1∶200作為抗原和一抗工作濃度。

2.4.2 包被條件的確定 如圖4所示，3種包被方法中4℃濕盒包被過夜可以顯著提高P/N值，因此選擇4℃濕盒包被過夜作為包被條件。

表1 截短VP7蛋白間接ELISA方陣滴定結(jié)果Table 1 The phalanx titrimetry of truncated VP7 as coating antigen by indirect ELISA

2.4.3 封閉液的確定 如圖5所示，1%明膠、3%明膠、1%BSA、3%BSA和1%酪蛋白作為封閉液時，P/N值都較高。明膠成本更低，因此選擇1%明膠作為封閉液。

2.4.4 二抗工作濃度的確定 如圖6所示，二抗1∶8 000稀釋時P/N值最大，因此選擇二抗的稀釋度為 1∶8 000。

2.4.5 判定標準的確定 根據(jù)25份陰性血清的OD492nm的平均值(X=0.146)和標準差(SD=0.059)確定其臨界值為0.146+0.059×3=0.323。為了便于判斷結(jié)果，定義樣品OD492nm≥0.32為陽性。

2.4.6 交叉反應性試驗 用建立的ELISA方法對4種常見牛病病毒的陽性血清進行檢測，結(jié)果取平均值。如表2所示，牛結(jié)核、BVDV、IBRV和FMDV陽性血清的檢測效價都低于0.32，均表現(xiàn)為陰性。

表2 交叉反應試驗結(jié)果Table 2 Cross reaction test for other bovine virus

2.4.7 競爭性抑制試驗 血清與病毒作用后進行ELISA試驗，OD492nm值均有降低，其中陽性血清反應值下降超過50%。表明IBAV可以抑制截短VP7蛋白對IBAV陽性血清的反應(圖7)。

2.4.8 ELISA檢測結(jié)果與中和試驗結(jié)果的對比 用建立的間接ELISA方法檢測95份樣本并與中和試驗結(jié)果進行比較，符合率約為77%。

2.5 臨床樣品檢測 用建立的間接ELISA方法對來自云南省的70份樣品進行檢測，共檢出陽性樣品32份，陽性率為45.7%。

3 討 論

環(huán)狀病毒屬成員的VP7蛋白在病毒粒子的包裝及穿越昆蟲宿主細胞膜的過程中起著重要的作用[6-7]。VP7蛋白整體疏水性較強，重組VP7蛋白更易形成包涵體，本研究經(jīng)低溫誘導，獲得了可溶性表達的截短 VP7。VP7氨基端(1 aa～120 aa)和羧基端(250 aa～349 aa)主要參與VP7蛋白的三聚體化[8]，因此疏水性較強。將這部分區(qū)域截去利于蛋白以可溶性式表達，降低了純化難度。另外，非變性條件下純化可能會一定程度上保留蛋白的構象表位，由于沒有變性劑干擾ELISA反應，因此，與本實驗室先前的研究結(jié)果相比[9]，截短VP7蛋白包被量更低，而且檢測效果更佳。

實驗中用建立的ELISA方法對4種常見牛病的陽性血清進行檢測，檢測效價均低于0.32；而競爭抑制試驗中IBAV可以抑制截短VP7蛋白對茨城病陽性血清的反應，證明了本方法具有較好的特異性。但由于實驗條件所限，本研究未能對藍舌病病毒(BTV)陽性血清進行檢測。BTV可以感染牛，而且環(huán)狀病毒屬成員間VP7蛋白的保守程度較高，所以用BTV陽性血清對本ELISA方法的特異性進行檢測是非常必要的。應用建立的間接ELISA方法對來自云南省的70份牛血清進行了檢測，IBAV抗體陽性率為45.7%。

IBAD在我國還未見流行的報道，但在我國牛場中存在的抗體陽性牛表明，對IBAV的感染狀況進行監(jiān)測是有必要的。本研究應用表達的截短IBAV VP7蛋白初步建立了IBAV血清抗體的間接ELISA檢測方法，為實現(xiàn)IBAV的快速診斷提供了一種可行手段。

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