殷 吉吉，張文龍，劉霓紅，楊 濤，步志高，王君偉，吳東來*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室，黑龍江哈爾濱150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

干擾素(Interferon，IFN)分為兩類：Ⅰ類IFN主要包括IFN-α、IFN-β；Ⅱ類IFN又稱為IFN-γ[1]。IFN-γ具有提高MHC分子表達、增強NK細胞殺傷作用、促進巨噬細胞的吞噬能力和炎癥反應(yīng)等免疫調(diào)節(jié)功能。IFN-γ作為一種天然的免疫應(yīng)答介導(dǎo)物，具有良好免疫佐劑作用。

殼聚糖(Chitosan，CS)是由甲殼素經(jīng)脫乙?；饔锰幚砗蟮漠a(chǎn)物，其化學(xué)名為聚-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖。作為一種天然的聚陽離子多糖化合物，CS廣泛分布于藻類、真菌、節(jié)肢動物及貝類等軟體動物的貝殼中。由于CS具有天然無毒性、良好的生物相容性、可降解、可再生性且原材料豐富、成本低等特點，有望成為廣泛使用的藥物載體。已有研究表明CS具有較強的核酸結(jié)合能力，可提高核酸對核酸裂解酶的穩(wěn)定性[2-3]，同時由于CS具有的天然免疫活性，還能協(xié)同增強核酸免疫作用[4]。

本實驗利用CS包裹含有禽源高效啟動子β-acting啟動子的雞IFN-γ表達重組質(zhì)粒pCAGGS-ChIFN-γ制備了CS納米顆粒(CNPs)，并對粒徑大小、Zeta電勢、DNA保護性能及體外轉(zhuǎn)染能力等方面進行了研究。

1 材料和方法

1.1 菌種、質(zhì)粒與實驗動物 雞IFN-γ真核表達重組質(zhì)粒pCAGGS-ChIFN-γ[5]、大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)菌種由本實驗室保存；9日齡～10日齡SPF雞胚由本所提供。

1.2 主要試劑及儀器 CS：分子量147 ku，脫乙酰度96.2%購自山東奧康生物制品有限公司；抗雞IFN-γ多克隆血清為哈爾濱獸醫(yī)研究所劉勝旺博士提供；DNA Marker、DNaseⅠ購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒中提試劑盒購自美國Promega公司；分析純級茚三酮購自上?；瘜W(xué)試劑公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；Opti-MEM、DMEM和胎牛血清購自美國GIBCO公司；殼聚糖酶、FITC標(biāo)記綿羊抗兔IgG和Hoechst 33258購自美國Sigma公司。Microplate Fluorescence Reader(FLx800)為Bio-Tek公司產(chǎn)品；JEM-1200透射電子顯微鏡為日本電子公司產(chǎn)品；3000HS型光子相關(guān)色譜儀為英國Malvern Instruments公司產(chǎn)品。

1.3 CNPs制備 將CS溶解在5 mmol/L NaAC緩沖液(pH5.5)中制成濃度為 200 μg/mL的 CS溶液，與含有 5 mmol/L Na2SO4的 DNA 溶液(100 μg/mL)分別預(yù)先加熱到50℃～55℃，等體積迅速混合，渦旋30 s，室溫放置1 h，即制備成CNPs膠體溶液[6]。

1.4 CNPs的藥劑學(xué)評價

1.4.1 CNPs納米粒的形態(tài)、粒徑和Zeta電勢的測定 取少量CNPs膠體溶液滴加于銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸負染，透射電子顯微鏡下觀察納米粒的形態(tài)。另取納米粒膠體溶液適量，用PCS測定納米粒平均粒徑、粒徑分布及Zeta電位。

1.4.2 CNPs的包封率和載藥量測定 包封率測定：取CNPs膠體溶液于高速冷凍離心機上(4℃，50 000 g，30 min)離心分離，按照每100 mL熒光劑緩沖液(2 mol/L NaCl，0.05 mol/L Na3PO4，pH7.4)加入 50 μL Hoechst 33258濃縮液(0.2 g/mL溶于水)，配置Hoechst 33258稀釋液。在白色96孔板中的4個孔中分別加入 0 μL，0.1 μL，1 μL，10 μL 適量稀釋的待測樣品，以Hoechst 33258稀釋至300 μL。充分混勻，用Microplate Fluorescence Reader測定樣品的相對熒光強度(F)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線c(ng/mL)=0.0752 F-1.5234計算溶液中游離的DNA含量，并按下式計算包封率：包封率(%)=(W總-W游)/W總×100%(W總：DNA的加入量；W游：上清液中DNA的測得量)。

載藥量測定：取CNPs膠體溶液于高速冷凍離心機上按上述條件離心分離，取上清液1.0mL置10mL量瓶中，加入2 mol/L pH5.5醋酸鈉緩沖液和1%茚三酮試劑各1 mL，重蒸水補至3 mL，混合均勻，于沸水浴加熱10 min，取出迅速冷卻至室溫，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置20 min，于570 nm處測定吸收度(A)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線c(μg/mL)=158.88 A-0.0749，計算溶液中游離CS的含量；按下式計算載藥量：載藥量(%)=WDNA/(WCS+WDNA)×100%。(WDNA：納米顆粒中DNA量；WCS：納米顆粒中CS量)。

1.4.3 凝膠阻滯分析 CNPs因荷正電而停止向正極的移動，滯留于加樣孔中。用凝膠阻滯分析法驗證DNA/CS多聚復(fù)合物的形成及電荷性質(zhì)。

1.4.4 DNA保護能力測定 將1 μg DNA和含10 μL CNPs 懸液(含 有 DNA 1 μg)分別 與 10 μL 40 u/mL的DNaseⅠ在37℃下作用15 min。在處理過的納米顆粒中加入16 μL 0.2 u/mL的CS酶溶液和4 μL 100 u/mL的溶菌酶溶液，37℃反應(yīng)4 h。同時設(shè)置DNaseⅠ陰性對照組與CS酶陰性對照組，以及先加入CS酶后加入DNaseⅠ對照組。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA降解情況。

1.4.5 體外轉(zhuǎn)染實驗 參照脂質(zhì)體LipolectamineTM2000使用說明進行轉(zhuǎn)染，同時取DNA相同含量的CNPs懸液轉(zhuǎn)染CEF細胞。72 h后棄去培養(yǎng)液，用PBST洗滌1次后自然干燥，用預(yù)冷700 mL/L乙醇4℃固定30 min，自然干燥。用PBST洗滌，取兔抗雞IFN-γ多克隆抗血清1∶20稀釋，每孔加入適量血清稀釋液，置濕盒內(nèi)37℃作用45 min。用PBST洗滌，自然干燥。將FITC標(biāo)記綿羊抗兔IgG按1∶160稀釋，每孔加入適量抗體稀釋液，置黑暗濕盒內(nèi)37℃作用45 min。用PBST洗滌，去離子水洗滌脫鹽后，分別利用熒光顯微鏡和Microplate Fluorescence Reader檢測熒光和相對熒光強度。

1.4.6 CNPs的穩(wěn)定性實驗 分別取4℃和室溫保存 5 個月的 10 μL CNPs子懸液(含有 DNA 1 μg)與10 μL 40 u/mL的 DNaseⅠ在 37℃下作用 30 min，加入碘乙酸溶液(終濃度為5 mM)終止反應(yīng)。同時設(shè)裸DNA對照組。

2 結(jié) 果

2.1 CNPs的形態(tài)、直徑和Zeta電勢的測定 制備的CNPs在電鏡下呈不規(guī)則球形，結(jié)構(gòu)緊密，大小較均一(圖1)。激光粒度分析儀測定結(jié)果表明，CNPs的平均粒徑為172.6 nm±5.1 nm，Zeta電勢20.8 mV±2.9 mV。

2.2 CNPs的包封率和載藥量的測定 測定結(jié)果表明制備的CNPs的包封率為91.21%±2.54%，載藥量為31.93%±0.16%。

2.3 凝膠阻滯分析與DNA保護性、釋放實驗 電泳結(jié)果顯示(圖2)，制備的CNPs滯留在上樣孔中，而DNA由負極向正極移動。CNPs在與CS酶作用后可以將包裹的DNA釋放。在DNaseⅠ的條件下裸露的DNA已經(jīng)被大部分降解，而CNPs由于有CS的保護未被DNaseⅠ降解，在與CS酶作用后依然可以釋放DNA。并且釋放后的DNA經(jīng)DNaseⅠ作用同樣可以被降解。

2.4 體外轉(zhuǎn)染實驗 分別在熒光顯微鏡下觀察和在Microplate Fluorescence Reader中檢測熒光和相對熒光強度。結(jié)果顯示(圖3)，CNPs可以在體外正確表達(圖3C)，但表達效率較低。CEF細胞對照組、CNPs子轉(zhuǎn)染CEF細胞組、DNA LipolectamineTM2000Reagent轉(zhuǎn)染 CEF組的 Microplate Fluorescence Readerp檢測結(jié)果分別為：26、134、820。CNPs體外轉(zhuǎn)染效率約為LipolectamineTM2000轉(zhuǎn)染效率的16.3%。

2.5 CNPs的穩(wěn)定性實驗 室溫與4℃保存5個月的CNPs均產(chǎn)生了不同程度的絮凝，去上清懸液，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：在與40 u/mL的DNaseⅠ反應(yīng)30 min，裸露的DNA幾乎被完全降解，而室溫與4℃保存5個月的CNPs均可以保持良好的DNA保護能力（圖4）。

3 討 論

CS具有良好的生物相容性和生物降解性，制備的CNPs具有緩慢釋放、靶向作用等特點，已被廣泛地用作藥物、酶等的載體[7]。1995年，Alexaki等首次報道CS溶液與DNA以自聚集的方式沉淀能得到一種大小為150 nm～500 nm的復(fù)合物，于是初步認為CS具有用于基因治療載體的潛在價值[8]。隨后的實驗證實：以CS作為載體物質(zhì)的疫苗經(jīng)口免疫能誘導(dǎo)產(chǎn)生對弓形蟲的有效免疫反應(yīng)[9]。李惠等通過體內(nèi)實驗證實，包裹后的質(zhì)粒DNA可以顯著提高目的基因-IL-2基因在體內(nèi)的表達，明顯增強體液和細胞免疫水平，增強對大腸桿菌的抗病能力[10]。

本研究將pCAGGS-ChIFN-γ[6]與CS進行包裝，形成CNPs。由于CS的包裹，使得包裝后的CNPs對DNA的保護能力明顯增強。實驗過程中所使用的DNaesⅠ的濃度(40 u/mL)遠遠高于生理環(huán)境下核酸酶的濃度，所以在正常生理條件下CNPs會對DNA起到非常好的保護作用。在保存5個月后CNPs已經(jīng)產(chǎn)生不同程度的絮凝，但上清中的CNPs依然具有良好的DNA保護作用。實驗中CNPs產(chǎn)生了絮凝，將會嚴(yán)重影響其產(chǎn)量與質(zhì)量，所以如何保存CNPs是今后需要解決的問題。

本研究采用的CS分子中96%以上的部分是由2-氨基葡萄糖苷重復(fù)單位組成，氨基基團重復(fù)單位的pKa為6.5左右，在pH5.5的條件下，CS帶大量正電荷。DNA的磷酸基團帶有多聚負電荷，因此CNPs通過兩者之間的電荷凝聚作用形成。實驗中將溶液加熱到50℃～55℃，可以降低溶液黏度，防止形成的CNPs發(fā)生聚集，而這個溫度不會對DNA造成損傷。通過DNA的釋放實驗證實，包裝成CNPs在與CS酶作用后依舊可以釋放出完整的DNA。同時在體外轉(zhuǎn)染實驗中證明細胞內(nèi)CNPs釋放后的DNA可以正確表達。

CS作為一種基因藥物載體存在許多優(yōu)點，但同樣也存在很多不足。筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)CNPs的轉(zhuǎn)染效率較低(約為脂質(zhì)體的16.3%)，而且CS只溶于微酸溶液，這將影響CS在實踐中的應(yīng)用。改造CS使之成為一種高效的基因藥物載體已成為目前亟待研究的課題。

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