郭東春，孫 ,2，劉家森，姜 騫，司昌德，林 歡，曲連東*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/實(shí)驗(yàn)動物中心，黑龍江哈爾濱150001；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)可以引起豬肺疫、牛羊出敗、禽霍亂等疾病，是一種重要的致病菌。鴨Pm是鴨霍亂的病原，為鴨養(yǎng)殖業(yè)中重要的細(xì)菌性傳染病之一[1]。該菌在世界各國廣泛流行，在我國規(guī)?；B(yǎng)禽場中也時有發(fā)生。

革蘭陰性細(xì)菌的外膜蛋白(Outer membrane proteins，OMPs)在致病過程中起著重要的作用，同時作為細(xì)胞膜中的一種重要成分具有良好的免疫原性，在免疫方面的作用越來越受關(guān)注。不同血清型分離株間的OMPs具有共同抗原成分，可以產(chǎn)生交叉保護(hù)作用。Omp H是Pm的主要外膜蛋白，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的保護(hù)性抗體。Chevalier等認(rèn)為Omp H位于菌體表面，是一種孔道形成蛋白，屬于非特異性細(xì)菌外膜脂蛋白超家族[2]。Luo等研究表明純化的天然Omp H誘導(dǎo)的保護(hù)率與全菌的保護(hù)率相當(dāng)；Omp H和全菌都能誘導(dǎo)高水平的ELISA抗體[3]。

本研究設(shè)計兩對引物擴(kuò)增了鴨Pm C48-102株的Omp H基因，同時實(shí)現(xiàn)了去信號肽的Omp H基因在大腸桿菌中的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 鴨源Pm株C48-102購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、質(zhì)粒pPRO-EX-htb由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 酶及主要試劑 EX-TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自上海華舜公司；鴨抗Pm陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備；HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG購自KPL公司。

1.3 Omp H基因的擴(kuò)增和克隆

1.3.1 引物設(shè)計 參考已發(fā)表的Pm 70株的Omp H序列設(shè)計兩對引物：PHF1：5'-CAAGGTAGTGATA CTATG-3'； PHR1： 5'-GCCAGTGTTTAACACTGGC-3'； PHF2： 5'-GCGGGATCCGCAACAGTTTACAAT CAAGAC-3'(下劃線為BamHⅠ位點(diǎn))；PHR2：5'-G GGCTCGAGTTAGAAGTGTACGCGTAAAC-3'(下劃線為XhoⅠ位點(diǎn))引物由上海invitrogen公司合成，PHF2和PHR2用于擴(kuò)增去信號Omp H基因片段。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 PCR模板為煮沸菌體上清；PCR反應(yīng)體系(50 μL)；反應(yīng)條件：94℃4 min，然后進(jìn)入32個循環(huán)：94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，最后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3.3 目的基因的克隆與鑒定 PHF1和PHR1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T連接，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆由上海invitrogen公司測序，并與GenBank中登錄的C44-1、P-1059、P52、X-73、PM-70和serogroup D Omp H進(jìn)行序列比對。

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 用BamHⅠ和XhoⅠ酶切回收PHF2和PHR2擴(kuò)增的去信號肽OmpH，同時用BamHⅠ和XhoⅠ酶切pPRO-EX-htb質(zhì)粒。將雙酶切的載體與Omp H基因片段連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pHTOmp H送上海invitrogen公司測序。

1.5 Omp H基因在BL221中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDSPAGE分析 取測序正確的pHT-Omp H轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個菌落，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值0.4～0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)5 h，同時設(shè)空白載體對照。用12%SDS-PAGE進(jìn)行電泳檢測。

1.6 Western blot分析 按常規(guī)方法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移后的NC膜在5%脫脂乳中封閉過夜，以1∶50用5%脫脂乳稀釋的鴨抗Pm陽性血清為一抗，37℃孵育1 h，以1∶2 500倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG為二抗，37℃孵育1 h，采用二氨基聯(lián)苯氨為底物顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 Omp H基因的擴(kuò)增與克隆 利用PHF1和PHR1擴(kuò)增鴨Pm C48-102株Omp H基因，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示：Omp H片段為1 180 bp，包含完整的ORF(1 056 bp)，編碼351個氨基酸，其中N'端20位氨基酸為信號肽序列。同時，利用PHF2和PHR2擴(kuò)增去掉N'端20位氨基酸信號肽的Omp H基因。

2.2 Omp H的序列分析 C48-102株Omp H基因與 GenBank中登錄的 C44-1、P-1059、P52、X-73、PM-70、serogroup D序列比對結(jié)果表明：在核苷酸水平上同源性為82.8%～99.2%；在氨基酸水平上同源性為82.1%～99.1%。對推導(dǎo)的C48-102株Omp H蛋白的分析，發(fā)現(xiàn)在220-238位氨基酸區(qū)域存在缺失。對 Pm 48-102、C44-1、P-1059、P52、X-73、PM-70、serogroup D的OmpH蛋白分析表明：不同分離株在80位～110位和220位～238位氨基酸存在部分缺失，這與報道的Pm Omp H基因和編碼的蛋白長度不同相一致[5-8]，這也可能導(dǎo)致不同Pm分離菌株的Omp H同源性低。

2.3 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用pHF2和pHR2擴(kuò)增的去掉N'端20位氨基酸信號肽的Omp H基因，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pHT-Omp H，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切得到1 056 bp目的條帶(圖1)。對pHT-Omp進(jìn)行測序，與原測序結(jié)果一致。

2.4 Omp H基因的原核表達(dá)及western blot檢測將pHT-Omp H轉(zhuǎn)化BL21，用IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在約41 ku處有一條明顯的表達(dá)帶，與預(yù)期的分子量大小相符(圖2A)。Western blot結(jié)果表明，表達(dá)的蛋白具有免疫學(xué)活性(圖2B)。Luo等研究表明：純化的菌體Omp H誘導(dǎo)的保護(hù)率與全菌的保護(hù)率一致，同時Omp H和全菌均能誘導(dǎo)高水平的ELISA抗體，但利用重組表達(dá)的蛋白質(zhì)Omp H所誘導(dǎo)的保護(hù)率較低，這可能與重組表達(dá)的蛋白是一種變性的蛋白，其高級結(jié)構(gòu)與天然蛋白不同有關(guān)[3,8]。

本研究實(shí)現(xiàn)了鴨Pm C48-102株去信號肽的Omp H基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)，SDS-PAGE及western-blot表明：表達(dá)的Omp H蛋白大小與預(yù)期相符，并具有免疫學(xué)活性，為下一步研制檢測鴨Pm血清學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

[1]B.W卡爾尼克主編，高福，蘇敬良主譯.禽病學(xué)[M].9版，北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1999，172-194.

[2]Chevalier G,Duclohier H,Thomas D,et al.Purification and characterization of protein H,the major porin ofPasteurella multocida[J].J Bacteriol,1993,175:266-276.

[3]Luo Y,Glisson J R.Cloning and characterization of the major outer membrane protein gene(ompH)ofPasteurella multocidaX-73[J].J Bacteriol,1997,179:7856-7864.

[4]Vasfi M M,Dubreuil J D,Mittal K R.The 32 kDa major outer membrane protein ofPasteurella multocidacapsular serumtype D[J].Microbiology,1996,142:199-206.

[5]Vasfi M M,Mittal K R.Role of outer membrane protein H(ompH)and ompA specific monoclonal antibodies from hybridoma tumors in protection of mice againstPasteurellla multocida[J].Infect Immun,1997,65:4502-4508.

[6]Ali H A,Sawada T,Noda K.Protectivity of an immunoaffinitypurified 39 kDa capsular protein of avianPasteurella multocidain mice[J].J Vet Med Sci,2004;66:1603-1604.

[7]Robert L D,Roslyn M,Baillie S,et al.Charaterization and comparison ofPasteurella multocidastrains associated with porcine pneumonia and atrophic rhinitis[J].Medical Microbiol,2003,52:59-67.

[8]Sthitmatee N,Numee S.Protection of chickens from fowl cholera by vaccination with recombinant adhesive protein ofPasteurella multocida[J].Vaccine,2008,(26):2398-2407.