聶明非，李 巖，溫 凱，賈 瑩，王君偉

(東北農業(yè)大學動物醫(yī)學院，黑龍江哈爾濱150030)

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea，BVD)是由BVD病毒(BVDV)引起的一種以腹瀉、黏膜病、持續(xù)感染、免疫抑制以及母畜流產為主要癥狀的接觸性傳染病[1]。該病呈全球性分布，給養(yǎng)牛業(yè)造成了很大的經濟損失。BVDV與豬瘟病毒(CSFV)、羊邊界病病毒(BDV)同屬黃病毒科瘟病毒屬成員，其基因組為單股正鏈RNA，全長約12.3 nt～12.5 nt[2]，整個基因組含有一個大的開放閱讀框架(ORF)和兩側的非翻譯區(qū)(UTR)[2]。

E2(gP53)位于BVDV ORF 2077位～3198位核苷酸，由374個氨基酸殘基組成，有5個可能的N-端糖基化位點,這些位點在BVDV不同毒株中非常保守，去糖基化分子量約為42 ku[3]。E2與Erns和E1是病毒的結構蛋白，形成表面突起伸向囊膜表面[4]。在BVDV所有結構蛋白之中，E2蛋白是免疫原性最強的糖蛋白，靠近N末端的一半含有多種依賴于構象的抗原結構域，其N端伸出BVDV囊膜表面，是決定BVDV抗原性的主要部位，也是與抗BVDV抗體結合、介導免疫中和反應及與宿主細胞識別、吸附的主要部位[5-7]。

本實驗利用BVDV基因免疫BALB/c小鼠，用病毒作為篩選抗原制備單抗，旨在篩選出針對BVDV的特異性單克隆抗體(MAb)，為BVD診斷方法的建立提供一定的物質材料。

1 材料和方法

1.1 病毒株、質粒、細胞及實驗動物 BVDV VEDEVAC株和CSFV C株、pcDNA-E2質粒、骨髓瘤細胞SP2/0、MDBK細胞由本實驗室保存；PK-15細胞由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所仇華吉研究員惠贈；4～6周齡清潔級BALB/c雌鼠購自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.2 主要試劑 FITC標記羊抗鼠IgG、HRP標記羊抗鼠IgG購自北京中衫金橋公司；FITC標記兔抗豬IgG、FITC標記兔抗牛二抗購自北京博奧森生物技術有限公司；HAT、HT選擇培養(yǎng)基、PEG3350、碘化丙啶(PI)、秋水仙素、4-氯-1-萘酚均購自Sigma公司；1640、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自天津灝洋生物有限公司；MAb亞類鑒定試劑盒購自Invitrogen公司；

1.3 MAb的制備

1.3.1 動物免疫 采用肌肉注射的方式，每只小鼠100 μg pcDNA-E2質粒，首免后每3周進行1次免疫，第3次免疫后1周進行加強免疫，1周后檢測抗體效價，達到要求后進行細胞融合。

1.3.2 MAb檢測方法的建立 對BVDV采用超速離心的方法進行純化，作為檢測抗原；小鼠三免后采血并分離血清為一抗，初步建立間接ELISA方法作為MAb的篩選方法。判定標準為陽性血清的OD450nm接近1.0，P/N最大。

1.3.3 細胞融合和克隆 參照文獻[8]進行細胞融合。采用間接ELISA方法篩選雜交瘤細胞，將得到的陽性細胞株用有限稀釋法進行細胞克隆純化，直到克隆細胞達到100%陽性后，擴大培養(yǎng)，并凍存。

1.4 MAb亞類的鑒定

1.4.1 MAb亞類鑒定 采用MAb亞類鑒定試劑盒進行鑒定。

1.4.2 MAb染色體鑒定 參照文獻[9]介紹的秋水仙素法對雜交瘤細胞進行染色體鑒定。

1.4.3 雜交瘤細胞的穩(wěn)定性檢測 將3株雜交瘤細胞凍存后復蘇，連續(xù)傳20代收集上清，用間接ELISA檢測培養(yǎng)上清中的抗體效價。

1.4.4 MAb western blot鑒定 用截短表達的6段重組E2蛋白進SDS-PAGE；轉印至硝酸纖維膜上，5%脫脂乳4℃過夜封閉；與MAb上清37℃作用2 h，PBST洗膜4次；再與HRP標記的羊抗鼠IgG 37℃作用1.5 h，PBST洗膜4次；4-氯-1-萘酚顯色，去離子水終止。

1.4.5 MAb與BVDV和CSFV的反應性 將生長良好的MDBK/PK-15細胞接種至96孔板，培養(yǎng)約18 h后接種BVDV/CSFV，繼續(xù)培養(yǎng)約48 h/70 h后4%多聚甲醛固定；PBS洗板后用三株MAb上清37℃孵育2 h，同時作陰陽性血清對照；PBS洗板后用FITC標記的羊抗鼠二抗/兔抗牛二抗/兔抗豬二抗(均1:200稀釋)，37℃孵育1.5 h，PBS洗板后用PI染色，在熒光顯微鏡下觀察。

2 結果與討論

2.1 MAb檢測方法的建立 純化后的病毒采用1∶200稀釋，包被液為pH9.6的碳酸鹽緩沖液，4℃過夜；5%脫脂乳37℃封閉2 h；陰陽性血清1∶800稀釋；羊抗鼠二抗1∶5 000稀釋 37℃孵育 1 h；TMB顯色8 min。

2.2 MAb亞類鑒定 經MAb亞類試劑盒鑒定，結果2E2和4D6為IgM類，3D12為IgG2a亞類，輕鏈均為κ鏈。

2.3 雜交瘤細胞染色體的鑒定 3株雜交瘤細胞經計算各10個分裂相的平均值，染色體數目為85條～95條，該數值大于脾細胞染色體數目的2倍，小于并接近脾細胞與骨髓瘤細胞的染色體數目之和，表明該株雜交瘤細胞確為脾細胞與骨髓瘤細胞融合而成。

2.4 雜交瘤細胞分泌MAb上清的穩(wěn)定性 將收集的20代上清進行間接ELISA檢測，讀取OD450nm，3株MAb的OD450nm沒有發(fā)生明顯變化，表明3株雜交瘤細胞均能穩(wěn)定分泌MAb。

2.5 MAb western blot鑒定 3株MAb均不能與截短表達的重組E2蛋白作用。這與本實驗的免疫原和篩選抗原有關?；蛎庖呤菍⒑芯幋a抗原基因的重組真核表達質粒直接免疫機體，使載體上的基因在體內經過轉錄、翻譯和修飾，持續(xù)表達出接近天然的抗原物質，E2的真核表達質粒進入小鼠體內后表達出與天然的E2相似的結構，用純化的病毒作為篩選抗原即可以篩選出針對E2構象表位和線性表位的抗體，并且本實驗細胞融合的次數較少，因此所制備的MAb針對構象表位是可能的。

2.6 MAb與BVDV和CSFV的反應性 BVDV與MAb上清的間接免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)：MAb 2E2、3D12和4D6均能識別結合BVDV，鏡下可見綠色熒光，陰性血清未現(xiàn)綠色熒光(圖1，2，3，4)；CSFV與MAb上清的間接免疫熒光結果顯示：MAb 3D12與CSFV反應出現(xiàn)熒光，MAb 2E2和4D6未發(fā)現(xiàn)熒光，表明MAb 2E2和4D6為針對BVDV的特異性MAb(圖5，6，7，8)。用 pcDNA-E2免疫小鼠，刺激機體產生了天然的E2蛋白，該蛋白上具有不同CSFV的抗原表位，以western blot和免疫熒光等檢測手段相結合，達到篩選特異性MAb的目的。張麗穎等[10]用重組蛋白免疫小鼠制備MAb，未篩選出針對BVDV的特異性MAb。因為重組蛋白和天然抗原性質不同，以此方法篩選出的MAb是針對線性表位的，而E2是糖蛋白，線性表位理論上不多[11]。

BVDV與CSFV同為瘟病毒屬成員，其基因序列和氨基酸序列有較高的同源性，并且有相似的感染譜[12]，常規(guī)的血清學方法不易區(qū)分BVDV和CSFV，給鑒別診斷帶來了一定的困難。E2是BVDV和CSFV的主要結構蛋白，是變異率最高的一種蛋白，根據間接免疫熒光結果表明BVDV和CSFV在構象上存在差異。因此，本實驗用E2的真核表達質粒作為免疫原，用病毒作為篩選抗原制備出針對BVDV的特異性的與CSFV不發(fā)生交叉反應的MAb，作為鑒別診斷的工具。但MAb亞類不利于應用，能否作為鑒別診斷的工具有待進一步研究。

[1]孔繁德，陸承平.牛病毒性腹瀉-粘膜病的最新研究進展[J].福建畜牧獸醫(yī)，2005，27(3)：8-9.

[2]Tautz N,Thiel H J,Dubovi E J,et al.Pathogenesis of mucosal disease:a cytopathic pestivirus generated by an internal deletion[J].Virology,1994,68:3289-3297.

[3]Collett M S,Laron R,Gold C,et al.Molecular cloning and nucleotide sequence of the pestivirus bovine viral diarrhea virus[J].Virology,1988,165:191-199.

[4]Thiel H J,Stark R,Weiland E,et al.G Hog cholera virus:molecular composition of virions from a pestivirus[J].Virology,1991,65:4705-4712.

[5]Donis R O,Corapi W V,Dubiovi E J.Bovine Viral Diarrhea Virus Proteins and theirAntigenic Analysis[J].Arch Virol.Suppl,1991,3:29-40.

[6]Weiland E,Stark R,Haas B,et al.Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disultide-linked heterodimer[J].Virology,1990,64:3563-3569.

[7]Xue W,Minocha H C.Identification of the Cell Surface Receptor for BVDV by Using Anti-idotypic Antibodies[J].Gen Virol,1991,65:73-79.

[8]Hedd Y Z.Monoclonal antibody technology handbook[M].周宗安，方元，房德興，譯.南京大學出版社，1992.

[9]徐志凱.實用單克隆抗體[M].西安：陜西科學出版社，1992：27-89.

[10]張麗穎，鮑永華，趙志輝.抗牛病毒性腹瀉病毒單克隆抗體的制備及其特性研究[J].中國獸醫(yī)科學，2009，39(01)：29-34.

[11]黃新，王新華，鐘發(fā)剛.牛病毒性腹瀉病毒瑪納斯株E2基因的克隆及其主要抗原表位區(qū)的分段表達[J].中國獸醫(yī)科學，2009，39(04)：321-326.

[12]Moormamm R J,Vang,Miedema G,et al.Infectious RNA transcribed from an engineered full length cDNA template of the genome of a pestivirus[J].Virology,1996,70(5):763-770.