葛風(fēng)華

(南方醫(yī)科大學(xué)2008級在職碩士, 廣東 廣州 510515)

AIDS患者人群的特殊性,有研究稱,口腔真菌感染的種類和耐藥性存在個體差異[1,2],其中念珠菌較多見,發(fā)病率約為20.6%-56%[3,4]。目前國內(nèi)外尚無更多涉及口腔真菌感染方面的大樣本、系統(tǒng)性研究,國外相關(guān)的報道也較少。因此,了解HIV/AIDS患者真菌感染、耐藥狀況,及其對抗病毒(HIV)治療的影響,對降低艾滋病臨床漏診率,改善患者生存質(zhì)量,提高臨床合理用藥水平具有重要意義。本文旨在獲得深圳地區(qū)HIV/AIDS患者口腔真菌感染狀況的第一手資料,包括菌種分布及耐藥情況等,為政府決策提供科學(xué)依據(jù),同時探討HIV/AIDS患者免疫狀態(tài)、真菌感染與抗病毒治療之間內(nèi)在聯(lián)系,為患者提供更安全合理的臨床用藥指導(dǎo)打基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:用咽拭子法收集 2009年12月至2010年11月深圳市第三人民醫(yī)院(東湖醫(yī)院)門診就診確診的AIDS患者200例,其中男性129例,女性71例,年齡21-76歲,平均43.5歲,取所有患者口腔分泌物為研究標(biāo)本,均為初次采樣,且未接受抗真菌、抗病毒治療,排除嚴(yán)重肝腎功能、心肺功能障礙。

1.2 方法:咽拭子法取有相關(guān)癥狀患者的口腔分泌物,采用10%KOH懸滴法檢查,在直接鏡檢下找到孢子或菌絲,臨床初步診斷為口腔真菌感染患者,用無菌棉簽取其分泌物,置無菌試管立即作培養(yǎng);鏡檢下未找到孢子和菌絲,但臨床高度可疑者,亦用無菌棉簽取其分泌物,置無菌試管作培養(yǎng),記錄患者性別,年齡,以及既往相關(guān)病史及用藥史,有無頻繁使用抗生素等。

1.3 試劑和儀器

1.3.1 主要試劑:由法國梅里埃提供的沙氏培養(yǎng)基、ATB fungus試劑盒(含6種抗真菌劑:5-氟胞嘧啶,兩性霉素B,制霉菌素,咪康唑,益康唑,酮康唑)、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株采用ATCC22019近平滑念珠菌,對所測試的6種抗真菌藥物均敏感,VIT EK YBC生化卡;主要儀器法國梅里埃提供的VITEK自動微生物檢測儀以及培養(yǎng)箱。

1.4 研究方法

1.4.1 真菌的培養(yǎng)、鑒定:①菌液的制備:將分泌物接種于氯霉素沙氏瓊脂平板上,30℃培養(yǎng)24-72h,若未見真菌菌落生長則繼續(xù)培養(yǎng)至7d;②生長菌落經(jīng)分純后,選取直徑2-3mm的3至4個獨立菌落混懸于0.45%鹽水中,用電子比濁器量度,使其濃度為2 Mc Farland;③真菌的鑒定:用VITEK YBC卡鑒定(鑒定值＞0.90),(將制備的菌液充填鑒定卡,平放在30℃的培養(yǎng)箱內(nèi)24h后,放入AMS培養(yǎng)/讀數(shù)箱,讀數(shù)器顯示結(jié)果;若未有最終結(jié)果,將鑒定卡再次平放在30℃的培養(yǎng)箱內(nèi)24h后,放入AMS培養(yǎng)/讀數(shù)箱,讀數(shù)器顯示最終結(jié)果。)

1.4.2 藥敏測試:采用法國生物梅里埃公司的ATB FUNGUS藥敏測試盒:①取100μ L上述含菌混懸液加于ATB F培養(yǎng)基中混勻,以微量加樣器加此液體于5-氟胞嘧啶的10孔及其前后各4個生長對照孔中,每孔135μ L;②取無菌緩沖液50μ L加入剩余的含菌培養(yǎng)基中,混勻,調(diào)整 pH。再將后者接種于余下12個藥物孔及4個對照孔中,每孔亦為135μ L;③蓋上塑料蓋放30℃孵育 24-48h。24h、48h各觀察1次,各抗真菌劑的含量及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)按ATB fungus操作指南進(jìn)行。當(dāng)生長對照各孔生長良好,而低濃度及高濃度藥物作用下生長完全受抑制,肉眼觀察無渾濁判斷為敏感;低濃度藥物作用下生長,高濃度藥物作用下不生長判斷為中敏;低濃度及高濃度藥物作用下均生長,肉眼觀察渾濁,判斷為耐藥。

1.4.3 抑菌圈標(biāo)準(zhǔn)判讀:5-氟胞嘧啶,咪康唑,益康唑,酮康唑,敏感(S)≥20mm,中介(I)12-19mm,耐藥≤11mm;兩性霉素B,制霉菌素,敏感(S)≥15mm,中介(I)10-14mm,耐藥不形成抑菌圈。

2 結(jié) 果

2.1 HIV/AIDS患者中口腔真菌的感染狀況:本組患者200例,分離到76例,陽性率為38%,其中白色念珠菌64例,占84.2%,馬爾尼非青霉菌5例,占6.6%,黑曲霉菌2例,占2.6%,圓弧青霉菌、桔青霉菌、暗色絲孢菌、酵母菌、熱帶念珠菌以及克柔念珠菌各1例,占1.3%。

2.2 真菌菌種耐藥分析:白色念珠菌對5-氟胞嘧啶、兩性霉素B和制霉菌素效果較好,酵母菌對咪康唑和酮康唑耐藥,咪康唑與益康唑?qū)谇咕Ч^差,馬爾尼非青霉菌咪康唑、益康唑、酮康唑和兩性霉素B均未見耐藥,圓弧青霉菌、桔青霉菌對所選六種藥物均敏感,熱帶念珠菌對咪康唑和益康唑耐藥,克柔念珠菌對咪康唑耐藥。

表1 各種檢出真菌耐藥率分布 n(%)

2.3 抗真菌藥物耐藥率:兩性霉素B為1例,占1.4%,酮康唑為2例,占2.8%,5-氟胞嘧啶為3例,占3.9%,制霉菌素為 3例,占4.1%,咪康唑為9例,占12.1%,益康唑為52例,占70.3%。

3 討 論

近年來,由于廣譜抗生素的大量使用引起菌群失調(diào)、二重感染,以及免疫抑制劑的使用、抗腫瘤藥物長期的應(yīng)用等因素,特別是艾滋病、吸毒者等人群的擴(kuò)大,使真菌感染的機會大大增加[5]。在臨床上,由于患者長期服藥,依從性差,以及抗真菌藥的不規(guī)范使用等因素,使得臨床耐藥真菌菌株亦不斷增加[6],耐藥機理日趨多樣化,頑固、重復(fù)感染的病例增多。目前,由條件致病菌導(dǎo)致的真菌感染已成為AIDS患者最常見、比例最大的機會性感染[7],同時也是其最重要的致死原因之一。調(diào)查表明,艾滋病患者合并真菌感染不僅已有耐藥現(xiàn)象存在,部分抗真菌藥物還可能影響艾滋病患者的抗HIV病毒治療,因此成為治療上的一大難題[8]。

口腔真菌的感染是AIDS患者最早出現(xiàn)的臨床體征之一,也是早期發(fā)現(xiàn)和診斷AIDS的重要線索[9]。其中以念珠菌感染居多,又以白色念珠菌常見,根據(jù)以往經(jīng)驗我們將HIV/AIDS患者口腔白色念珠菌感染分為:假膜型、顆粒型、紅斑型、口角炎型4型。本研究發(fā)現(xiàn)白色念珠菌者64例,占84.2%,其次馬爾尼非青霉菌也較常見,主要影響患者呼吸以及單核網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),主要在東南亞以及我國南部流行,感染者以青壯年居多,治療上首選兩性霉素B和酮康唑[10]。其余以少見機會致病菌多見,在治療上兩性霉素B體外抗真菌活性最強,但其腎毒性限制了它的臨床使用,建議用氟康唑和氟胞嘧啶聯(lián)合治療以殺滅氟康唑耐藥株,以伊曲康唑代替氟康唑治療也是一個好的選擇[11]。向黎研究表明在臨床治療中選用敏感性抗真菌藥物的2聯(lián)用藥,主要是提高其抗真菌藥物的活性,起到協(xié)同作用,避免誘導(dǎo)耐藥株產(chǎn)生。隨著我國對艾滋病防治的日益重視和投入逐年加大,部分艾滋病患者出現(xiàn)真菌感染比例較高的省份(如廣西),已決定開始為艾滋病感染者提供免費的抗真菌治療藥物(包括目前最常用的伊曲康唑膠囊、氟康唑片等)。

初步估計,每名獲準(zhǔn)的患者一年需要投入上萬元,而據(jù)國家衛(wèi)生部統(tǒng)計,截止2007年底,全國已有約70萬HIV/AIDS患者,這個政策一旦推廣,涉及金額將十分龐大。因此,HIV/AIDS患者的真菌感染、耐藥基線水平,以及如何選擇抗真菌藥物種類的問題,還事關(guān)政府衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)管理決策的重大研究。本研究以臨床疑似合并口腔真菌機會性感染的HIV/AIDS患者為調(diào)查對象,對其分離的真菌作菌種及抗真菌藥物的敏感性分析,了解目前各菌種在致病真菌中所占比例,及其對抗真菌藥物的敏感程度是否有變化,為臨床提供用藥指導(dǎo),并為進(jìn)一步作真菌耐藥菌株基因型分析,從分子水平研究耐藥機理奠定基礎(chǔ)。

[1]Vandenbossche I,Vaneechoutte M,Vendevenne M,et al.Susceptibility testing of fluconazole by the NCCLS broth mairodilution method,E-test,and disk diffusion for application in the routine labratory[ J].Clin Microbiol,2002,40(3):211-214.

[2]吳嵐,周曾同,唐國瑤.口腔念珠菌基因型和扁平苔蘚的關(guān)系[J].2004,13(6):544-548.

[3]Khongkunthian P,et al.Oral Pathol Med,2001,30(4):220-223.

[4]Lee CC,et al.Ann Acad Med Singapore,1997,26(6):83-85.

[5]陳建鋼,鐘志華,吳小燕,等.武漢大學(xué)學(xué)報,2003,24(1):83-85.

[6]Alexander BD,Perfect JR.Anrifungal resisitance trends towards the year 2002[J].Drugs,1997,54(5):657.

[7]雷華,李永綺,游晶.傳染病信息,2007,20(2):122.

[8]李多,李慶福.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2007,23(10):633.

[9]劉曉松,劉宏偉,郭子杰,等.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,2005,40(3):211-214.

[10]馬沛卿,郎振為,沈冰,等.艾滋病合并馬爾尼非青霉菌感染2例的病理特點[J].中華傳染病雜志,2006,24(5):338-341.

[11]Antoniadou A,Torres HA,Lewis RE,et al.Candidemia in a tertiary care cancer center:in vitro susceptibility and its association with outcome of initial antifungal therapy[J].Medicine,analytical reviews of general medicine neurology psychiatry dermatology and pediatries,2003,82(5):309-321.