羅旭松 周廣東 曹誼林

組織工程化氣管的研究進(jìn)展

羅旭松 周廣東 曹誼林

先天畸形、外傷和腫瘤等引起的氣管缺損臨床常見，長(zhǎng)段氣管狹窄患者的死亡率可高達(dá)77%，長(zhǎng)段氣管閉鎖的死亡率基本為100%。氣管缺損較短時(shí)（＜6 cm），首先考慮斷端拉攏吻合，而當(dāng)缺損長(zhǎng)度超過總長(zhǎng)度的一半時(shí)（＞6 cm），則無法直接吻合，需要進(jìn)行氣管重建。氣管處于一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，對(duì)外開放，有菌，鄰近有重要的血管、神經(jīng)結(jié)構(gòu)，承擔(dān)著多項(xiàng)重要的生理功能，并要承受正壓和負(fù)壓的周期波動(dòng)。這些都對(duì)氣管重建提出了嚴(yán)格的要求，要求其有足夠的強(qiáng)度和彈性以保持管腔通暢，氣密性好，同時(shí)修復(fù)手術(shù)應(yīng)簡(jiǎn)便、安全。

但是，目前臨床和實(shí)驗(yàn)研究中常用的3種重建方法都不能完全符合上述要求。①自體組織移植：曾嘗試過以筋膜、骨膜、心包、肌皮瓣、軟骨片甚至食管、空腸等進(jìn)行氣管重建，不僅會(huì)犧牲部分正常組織，而且移植物與正常氣管的組織結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性相差較大，往往最終被吸收，為瘢痕組織所替代[1－3]；②異體氣管移植：該方法使患者術(shù)后需終身使用抗免疫藥物，且供體來源有限，并存在著傳染疾患的可能[4]；③人工材料的應(yīng)用：常見的有金屬和高分子假體，植入后容易出現(xiàn)感染和排斥，甚至可能侵蝕鄰近血管而引起大出血[5]。這些缺點(diǎn)使得氣管缺損的修復(fù)一直是困擾臨床的難題[6]。

組織工程技術(shù)的興起和快速發(fā)展，為氣管缺損修復(fù)提供了新的思路，有望成為最理想的治療方法。1994年，Vacanti等[7]首先報(bào)道了對(duì)組織工程化氣管的研究，以牛的軟骨細(xì)胞與聚乙醇酸（P olyglycolic acid，PGA）在裸小鼠皮下構(gòu)建出具有一定強(qiáng)度的管狀透明軟骨，用于修復(fù)裸大鼠的氣管缺損，術(shù)后的裸大鼠可以自主呼吸，最長(zhǎng)存活1周。但迄今為止，組織工程化氣管研究仍以構(gòu)建研究為主，有部分研究嘗試了實(shí)際修復(fù)氣管缺損，但僅在對(duì)范圍較小的局部缺損進(jìn)行片狀修補(bǔ)[8－10]，主要是增加氣管橫截面，解決了氣管狹窄的問題。而對(duì)于范圍較大的節(jié)段性缺損進(jìn)行修補(bǔ)重建，則一直沒能取得很大進(jìn)展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后存活均不超過1個(gè)月[7,11－12]。2008年，巴塞羅那大學(xué)進(jìn)行了世界首例組織工程化氣管臨床移植[13]，為以組織工程技術(shù)解決氣管缺損帶來了希望，但是，這項(xiàng)研究還有很多問題尚未解決。

1 種子細(xì)胞

氣管由“C”形的透明軟骨和纖維肌膜組成，從內(nèi)向外依次為黏膜層、黏膜下層和軟骨纖維層，其中最重要的兩類組織為軟骨和呼吸上皮，組織工程化氣管的構(gòu)建主要針對(duì)這兩種組織進(jìn)行。種子細(xì)胞即為具備形成軟骨功能的軟骨種子細(xì)胞和能形成呼吸上皮的上皮種子細(xì)胞。種子細(xì)胞的來源一般有兩類：一類是采用分化細(xì)胞，如成體軟骨細(xì)胞和成體氣道上皮細(xì)胞，優(yōu)點(diǎn)是分化明確，構(gòu)建效果好，缺點(diǎn)是已分化細(xì)胞在體外隨著擴(kuò)增代數(shù)的增加易老化和去分化；另一類種子細(xì)胞是干細(xì)胞，包括成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，由于干細(xì)胞從理論上具有自我更新、高度增殖、有多向分化能力和免疫原性弱等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來成為研究熱點(diǎn)。目前的研究中，干細(xì)胞的分離純化不易，誘導(dǎo)分化過程比較復(fù)雜，且最終的構(gòu)建效果不夠理想。

1.1 軟骨種子細(xì)胞

1.1.1 軟骨細(xì)胞

可以從軟骨組織中取材，用Ⅱ型膠原酶消化分離出軟骨細(xì)胞，再將細(xì)胞置于含有胎牛血清的F-12或DMEM等培養(yǎng)液中培養(yǎng)擴(kuò)增，一般采用2～3代以內(nèi)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行構(gòu)建。

Kojima等[11]采用羊鼻中隔的軟骨細(xì)胞和PGA復(fù)合物植入裸大鼠和羊的頸部，8周后均形成氣管樣組織，用于修復(fù)羊頸部5 cm長(zhǎng)的氣管節(jié)段缺損，術(shù)后羊存活了2～7 d。本實(shí)驗(yàn)室將兔耳廓軟骨細(xì)胞和管狀PGA材料復(fù)合物，植于裸鼠皮下6周，形成大體外觀、組織學(xué)結(jié)構(gòu)均與兔氣管軟骨相似的管狀軟骨，用于修復(fù)兔氣管節(jié)段缺損，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后可自主呼吸，平均存活12.3 d，最長(zhǎng)存活28 d[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）[14]和胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）[15]對(duì)于以軟骨細(xì)胞構(gòu)建透明軟骨具有積極作用。

上述研究都是采用自體軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞，由于軟骨組織的免疫原性較弱，也有研究嘗試采用異體軟骨細(xì)胞進(jìn)行構(gòu)建研究。Fuchs等[9]用胎牛的耳軟骨和氣管軟骨的軟骨細(xì)胞，在體外構(gòu)建異體組織工程化軟骨片，植入胎牛的氣管行氣管擴(kuò)大術(shù)，胎牛出生后可以自主呼吸，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)組織工程化軟骨片最終形成了正常的透明軟骨，與周圍組織整合良好，并上皮化，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的免疫排斥現(xiàn)象。

1.1.2 具軟骨分化潛能的干細(xì)胞

1.1.2.1 成體干細(xì)胞

最典型的就是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Stromal Cells，BMSC）。BMSC在一定的環(huán)境和因子的作用下，可以向軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等定向分化[16]。Fuchs等[10]將牛的BMSC接種于可降解材料后，用含TGF-β1的培養(yǎng)液培養(yǎng)3個(gè)月，另外取牛胚胎軟骨細(xì)胞接種于同一種材料，兩種復(fù)合物均植入修復(fù)胎牛氣管，于植入前和胎牛出生時(shí)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，所有BMSC材料復(fù)合物均表現(xiàn)軟骨分化，植入前兩組的Ⅱ型膠原與葡萄糖胺聚糖（G lycosaminoglycan，GAG）水平與正常牛胚胎軟骨類似；BMSC組的GAG水平更高，而Ⅱ型膠原水平兩組無明顯差異；但是植入體內(nèi)后，兩組之間無明顯差異。Kojima等[17]將羊的BMSC接種于PGA支架上，先在體外加入TGF－β2和IGF培養(yǎng)1周，細(xì)胞－支架復(fù)合物覆蓋一層可緩釋TGF－β2的明膠微球后，置入裸鼠皮下6周，可形成軟骨組織，其中GAG和羥脯氨酸含量類似正常軟骨。本實(shí)驗(yàn)室在體外以BMSC為種子細(xì)胞，成功構(gòu)建出軟骨，證實(shí)該軟骨在植入體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間仍能保持軟骨的組織學(xué)特性[18]。

近年來，有學(xué)者相繼采用牛的羊水間充質(zhì)細(xì)胞[19]、牛的臍帶血間充質(zhì)前體細(xì)胞[20]和人的脂肪源間充質(zhì)細(xì)胞[21]成功構(gòu)建出組織工程化軟骨，一般認(rèn)為這些細(xì)胞類似BMSC，也屬成體干細(xì)胞，甚至認(rèn)為它們可能就是來源于BMSC。對(duì)這些細(xì)胞的研究大大拓展了組織工程化氣管構(gòu)建的種子細(xì)胞來源。

1.1.2.2 胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞具有無限增殖和全能分化的特性，可能是一種良好的種子細(xì)胞。軟骨的形態(tài)發(fā)生要經(jīng)過一系列過程，這其中重要的誘導(dǎo)信號(hào)有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）、軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白（CDMPs）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGFs）等[22]。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)的要求極高，很容易分化，而定向分化和純化的難度較大。Hegert等[23]發(fā)現(xiàn)，從小鼠胚胎干細(xì)胞來源的軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)可以轉(zhuǎn)分化為成骨和成脂肪細(xì)胞等其他間質(zhì)細(xì)胞類型。

1.2 呼吸上皮種子細(xì)胞

覆蓋鼻腔、氣管和支氣管的呼吸上皮是假復(fù)層纖毛柱狀上皮，主要細(xì)胞成分是纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和基細(xì)胞，這些細(xì)胞的基底端均附于基膜上。氣管修復(fù)手術(shù)后，氣道上皮及時(shí)覆蓋替代物，可以促進(jìn)分泌物排出，抑制吻合口肉芽增生，防止管腔狹窄和堵塞。氣管的主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ（MHC-Ⅱ）抗原就位于黏膜上皮細(xì)胞和黏膜下層中的腺體細(xì)胞中，在氣管軟骨細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中并無表達(dá)。因此，構(gòu)建組織工程化呼吸上皮，主要采用自體上皮細(xì)胞為種子細(xì)胞。構(gòu)建物上皮化有兩種方法：一種是氣管缺損修復(fù)后，鄰近的正常氣道上皮細(xì)胞爬行覆蓋，可以在組織工程化氣管內(nèi)腔面以生長(zhǎng)因子、黏附蛋白等修飾以促進(jìn)細(xì)胞爬行；另一種方式是在構(gòu)建軟骨的同時(shí)構(gòu)建上皮，形成復(fù)合組織再進(jìn)行修復(fù)[24－26]。

1.2.1 氣道上皮細(xì)胞

氣道上皮細(xì)胞可以通過組織塊培養(yǎng)法和消化法得到，后者一般用Dispase過夜冷消化，再用胰酶快速消化得到。氣道上皮的培養(yǎng)比軟骨細(xì)胞復(fù)雜和困難，在常規(guī)的培養(yǎng)皿里上皮細(xì)胞貼壁較難，需預(yù)先鋪層，常用膠原、G elatin和F ibronectin進(jìn)行鋪層，也可采用3T3細(xì)胞等。由于血清影響上皮細(xì)胞增殖，上皮細(xì)胞的培養(yǎng)一般采用無血清特殊培養(yǎng)基，需添加上皮生長(zhǎng)因子等。氣道上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代的過程中很容易出現(xiàn)去分化，使纖毛消失，向成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變，維持原有表型困難，故一般采用氣－液界面培養(yǎng)。Le Visage等[27]以Transwell為人間充質(zhì)干細(xì)胞（M esenchymal stem cells，MSCs）和人支氣管上皮細(xì)胞（N ormal human bronchial epithelial cells，NHBE）的共培養(yǎng)體系，MSCs在皿底培養(yǎng)，NHBE在液氣界面進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)黏液分泌量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)的NHBE在第18～25天之間分泌量保持恒定，而對(duì)照組則在第21天時(shí)分泌量達(dá)到峰值，說明間充質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞的相互作用對(duì)維持上皮細(xì)胞的分化是有幫助的。

Sakata等[24]先在裸鼠體內(nèi)形成組織工程化管狀軟骨，將其中支撐用的模具抽出后，以另外培養(yǎng)的新生羊氣管上皮細(xì)胞制成的細(xì)胞懸液注入管腔，兩端閉合后繼續(xù)培養(yǎng)，3周后腔面形成假復(fù)層柱狀上皮，部分細(xì)胞可觀察到纖毛結(jié)構(gòu)，并形成黏膜下組織和豐富的小血管。Walles等[28]將肋軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞一同種植在生物支架上，經(jīng)檢測(cè)證實(shí)，平滑肌細(xì)胞和有纖毛的呼吸道上皮細(xì)胞種植成活且具有功能。

1.2.2 氣道上皮干細(xì)胞

Borthwick等[29]發(fā)現(xiàn)，在小鼠氣管粘膜下的腺管中，有一種獨(dú)特的細(xì)胞類群表達(dá)高水平的角蛋白，氣道損傷后用溴脫氧尿苷（BrdU）標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞可以維持標(biāo)記存在，被認(rèn)為是氣道上皮干細(xì)胞。Coraux等[30]發(fā)現(xiàn)，在Ⅰ型膠原誘導(dǎo)下，胚胎干細(xì)胞能夠分化成為無纖毛的氣道分泌細(xì)胞（Clara細(xì)胞），而在氣－液界面培養(yǎng)的條件下，胚胎干細(xì)胞可以形成分化完全的氣道上皮，含有纖毛細(xì)胞、基底細(xì)胞、中間上皮細(xì)胞和Clara細(xì)胞，類似于正常的氣管支氣管上皮。

2 支架材料

氣管組織工程支架常用的有合成類的PGA、PLA、PLGA等，及天然類的膠原、糖氨聚糖、殼聚糖、脫細(xì)胞基質(zhì)等。

合成材料的優(yōu)點(diǎn)是可以控制材料的很多性狀，如顯微結(jié)構(gòu)、孔隙率、降解時(shí)間和強(qiáng)度等，可塑性強(qiáng)，便于規(guī)模生產(chǎn)。PGA是最簡(jiǎn)單的線性脂肪族聚酯，是高度結(jié)晶聚合物，抗張強(qiáng)度好，降解半衰期為2周；PGA在體內(nèi)先水解為羥基乙酸，再轉(zhuǎn)換為乙醇酸交酯，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終從腎臟排出。為增加PGA材料的硬度和降解時(shí)間，可以在PGA中加PLA，或應(yīng)用PLGA。PLA的特點(diǎn)是易加工處理且生物力學(xué)性能好，降解速率較慢，可以延長(zhǎng)支架材料的存在時(shí)間，以使種子細(xì)胞能夠產(chǎn)生足夠的細(xì)胞外基質(zhì)。這兩種材料的缺點(diǎn)是容易造成局部組織酸性降解產(chǎn)物堆積，在體內(nèi)會(huì)引發(fā)炎癥反癥[31－32]。由于在構(gòu)建組織工程化氣管的起始階段，細(xì)胞－材料復(fù)合物力學(xué)性能較弱，為支持材料三維空間結(jié)構(gòu)和引導(dǎo)構(gòu)建的氣管組織形狀，往往需要采用支撐模具[33]，一般是采用硅膠和高分子材料，待其自身支撐力度足夠后再撤除模具。

天然材料更接近細(xì)胞在體內(nèi)的生存環(huán)境，其中細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)過處理可以去除其中的抗原成分，而保留其有效成分和整體結(jié)構(gòu)的完整性。因此，天然材料是軟骨組織工程材料的一種良好選擇[13]。黃桂林等[34]用改良的去污劑－酶聯(lián)合多步法脫除家兔、SD大鼠的氣管組織中的細(xì)胞，然后將脫細(xì)胞氣管植入SD大鼠面頰部，發(fā)現(xiàn)植入12周后與周圍組織相容較好，未見明顯管腔塌陷及炎性反應(yīng)。

3 構(gòu)建方法

3.1 體外構(gòu)建

從組織工程產(chǎn)品未來的臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化角度，應(yīng)能直接在體外構(gòu)建組織，但目前單純體外構(gòu)建出的軟骨存在基質(zhì)形成較差、強(qiáng)度不夠等問題，不能夠直接用于修復(fù)缺損。其原因可能是，傳統(tǒng)的復(fù)合物置于培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶中的靜態(tài)培養(yǎng)無法模擬正常軟骨在體內(nèi)的應(yīng)力環(huán)境，而且靜態(tài)培養(yǎng)不能及時(shí)更新營養(yǎng)物質(zhì)和排出代謝產(chǎn)物，也很難模擬體內(nèi)多種生長(zhǎng)因子、多種因素綜合作用這樣一個(gè)復(fù)雜環(huán)境。為了克服這些問題，有學(xué)者希望通過生物反應(yīng)器產(chǎn)生應(yīng)力，動(dòng)態(tài)地提供營養(yǎng)，盡可能地模擬體內(nèi)環(huán)境；同時(shí)某些生物反應(yīng)器還可以動(dòng)態(tài)地將種子細(xì)胞種植在材料上，提高了種植效率和效果[35]。

另有一些研究表明，一定時(shí)間的體外培養(yǎng)會(huì)對(duì)隨后的體內(nèi)培養(yǎng)構(gòu)建有幫助。Farhadi等[36]將人鼻中隔軟骨細(xì)胞接種在酯化透明質(zhì)酸材料后，先在體外培養(yǎng)2周，再植入祼鼠皮下，2周后形成軟骨，與直接植入祼鼠形成的軟骨相比，Ⅱ型膠原和GAG含量均增高，縫合強(qiáng)度增加2倍左右，抗彎強(qiáng)度和抗拉強(qiáng)度均顯著改善，與正常軟骨接近。B all等[37]將雄性新西蘭大白兔的軟骨膜細(xì)胞接種在PLA支架上，經(jīng)體外預(yù)培養(yǎng)7 d后，植入雌性兔膝關(guān)節(jié)修復(fù)骨、軟骨缺損，通過對(duì)Y染色體短臂上的SRY基因進(jìn)行標(biāo)記和半定量PCR推算留存供體細(xì)胞，證實(shí)植入后預(yù)培養(yǎng)組和直接植入組的供體細(xì)胞都大幅度下降，但預(yù)培養(yǎng)組存留的供體細(xì)胞明顯多于直接植入組。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的具體機(jī)制還不清楚，可能是經(jīng)過體外預(yù)培養(yǎng)，形成了一定量的初步組織包裹種子細(xì)胞和材料纖維，使之不直接暴露于體內(nèi)組織環(huán)境，對(duì)種子細(xì)胞的干擾不大，減輕了材料直接植入引起的炎癥反應(yīng)[38]，從而提高了目標(biāo)組織的形成質(zhì)量，使構(gòu)建和修復(fù)結(jié)果的可重復(fù)性好。

3.2 體內(nèi)構(gòu)建和血管化

體內(nèi)構(gòu)建與修復(fù)的關(guān)系一般有兩種：一種是直接在修復(fù)部位構(gòu)建，構(gòu)建成功時(shí)同時(shí)也達(dá)到修復(fù)目的；另一種是異位構(gòu)建，即先在其他正常位置構(gòu)建后再移位到病損部位進(jìn)行修復(fù)。這兩種構(gòu)建都會(huì)面臨的一個(gè)重要問題就是新組織在修復(fù)部位的再血管化，尤其當(dāng)缺損范圍較大，或修復(fù)區(qū)域存在嚴(yán)重瘢痕，血循環(huán)差，存在感染的種種不利情況，此時(shí)通過適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)構(gòu)建方式以快速形成良好的血供對(duì)于組織工程化組織的成功構(gòu)建具有關(guān)鍵的作用[39]。

研究表明，在修復(fù)部位采取促進(jìn)血管生成的因子,如bFGF[40]和VEGF[41]等，或者修復(fù)后用富含血供的組織如肌瓣、網(wǎng)膜等將移植物和修復(fù)部位覆蓋包裹，也會(huì)促進(jìn)移植物的成活。Teramachi等[42]在采用大網(wǎng)膜包裹人工氣管假體吻合口的研究中發(fā)現(xiàn)，快速而多量的血管生長(zhǎng)進(jìn)入新生黏膜是實(shí)現(xiàn)黏膜生長(zhǎng)、上皮覆蓋的關(guān)鍵。Atala等[43]將擴(kuò)增的尿道上皮和肌肉細(xì)胞種植于膀胱形狀的膠原或膠原-PGA復(fù)合材料上，體外構(gòu)建后行自體內(nèi)植入，以此方法對(duì)7個(gè)患有脊髓脊膜突出癥的患者進(jìn)行膀胱成形術(shù)，術(shù)中部分病人構(gòu)建膀胱上覆蓋大網(wǎng)膜，對(duì)照組不覆蓋。術(shù)后平均46個(gè)月的隨訪表明，網(wǎng)膜覆蓋組重建后的膀胱體積和順應(yīng)性都明顯好于不覆蓋組。

很多研究采用在富含血供的組織內(nèi)進(jìn)行組織構(gòu)建，然后攜帶血供對(duì)缺損部位進(jìn)行修復(fù)，使構(gòu)建組織血管化更有保障，無需重建血運(yùn)[44-45]。Kneser等[46]詳細(xì)討論了軸形血管化組織工程骨修復(fù)較大骨缺損的方法[46-48]。

組織工程化組織在機(jī)體內(nèi)血管化的具體機(jī)制尚不明確，可能與植入后引發(fā)的炎癥反應(yīng)有關(guān)[49-50]。在炎癥和酸性環(huán)境中，巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放各種生長(zhǎng)因子（主要是FGF與VEGF），刺激新生毛細(xì)血管向構(gòu)建組織內(nèi)生長(zhǎng)，供給氧分和營養(yǎng)物質(zhì)。也有研究認(rèn)為，支架材料與血管化的程度有關(guān)，PLGA在局部組織內(nèi)可引發(fā)明顯的血管新生反應(yīng)，形成較密集的毛細(xì)血管，而膠原-殼聚糖-羥基磷灰石水凝膠復(fù)合材料誘導(dǎo)血管新生的能力很弱[51]。

4 展望

組織工程研究將生物技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)緊密地結(jié)合，有望成為修復(fù)重建外科的核心技術(shù)和最重要的手段。組織工程化氣管的研究幾乎涵蓋了該領(lǐng)域的各種熱點(diǎn)問題，目前尚處于實(shí)驗(yàn)和探索階段，其研究將隨著相關(guān)的種子細(xì)胞研究和新材料的開發(fā)而不斷進(jìn)步。

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Q813.1+3

A

1673－0364（2010）03－0167－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.03.014

2010年2月1日；

2010年3月20日)

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科；上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。