劉石泉 雷存喜 趙運林*

( 1 湖南城市學院化學與環(huán)境工程系 湖南益陽 413000 2 湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院 湖南長沙 410128 )

黑茶屬于后發(fā)酵茶，是我國特有的一大茶類，其生產(chǎn)歷史悠久、產(chǎn)區(qū)廣闊、銷售量大、花色品種多。黑茶加工過程中渥堆處理被認為是發(fā)展形成黑茶特有品質(zhì)的關(guān)鍵工序，雖然不同花色品種所采用的渥堆技術(shù)條件不盡相同，但目的都是促使粗老的鮮葉原料通過一定程度的發(fā)酵，形成葉色黑潤、味醇和、香氣純正、湯色黃紅明亮的品質(zhì)特征，實際上就是在微生物的作用下使以茶多酚為主的化學成分發(fā)生一系列的化學變化[1,2]。

盡管近些年微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性在其它領(lǐng)域成為研究的熱點，但在黑茶發(fā)酵工藝中其研究遠沒有得到應有的重視。文獻檢索發(fā)現(xiàn)對黑茶的微生物研究主要集中在黑茶樣品中微生物的種類組成、分離、鑒定、發(fā)酵條件、發(fā)酵產(chǎn)物等方面，而且主要是針對樣品中的優(yōu)勢菌株進行研究。顯然，黑茶中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究，對黑茶特有品質(zhì)的高持續(xù)穩(wěn)定特性的實現(xiàn)與強弱等有著非常重要的作用。因此，通過對黑茶發(fā)酵環(huán)境微生物群落的種群結(jié)構(gòu)和多樣性進行深入探查并研究其動態(tài)變化，可以為優(yōu)化黑茶發(fā)酵群落結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)群落功能和發(fā)現(xiàn)新的重要微生物功能類群提供可靠的依據(jù)?；诖?，我們對目前黑茶發(fā)酵中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究現(xiàn)狀、目前研究方法的局限性進行簡要分析，以利于更好的研發(fā)這一特色產(chǎn)品。

1 黑茶中的微生物研究現(xiàn)狀

黑茶發(fā)酵過程中微生物種類復雜，貫穿整個發(fā)酵流程，不同工藝時期、不同種類黑茶品質(zhì)形成過程中的優(yōu)勢菌不一定相同，優(yōu)勢菌和非優(yōu)勢菌共同組成了渥堆中特有的微生物群落結(jié)構(gòu)，各自發(fā)揮著應有的功能和作用。

1.1 黑茶加工中微生物種類

研究表明[3]，黑茶在加工過程中微生物群落主要是酵母菌、霉菌和細菌。溫瓊英[4]研究表明，黑毛茶渥堆過程中優(yōu)勢微生物種群是假絲酵母屬中的種群、黑曲霉屬、青曲霉屬，初期還有大量細菌，主要是無芽孢小桿菌、芽孢細菌、金黃色葡萄球菌。

對普洱茶的研究[5,6]表明：主要微生物有黑曲霉、青霉、根霉、灰綠曲霉、酵母、蠟中枝孢霉和細菌。周紅杰[5]發(fā)現(xiàn)，黑曲霉、青霉、根霉、灰綠曲霉和酵母等微生物存在于普洱茶整個渥堆發(fā)酵過程中，初期黑曲霉占到微生物總數(shù)的80%左右，后期灰綠曲霉開始繁殖。陳可可[6]等在不同產(chǎn)地的普洱茶中發(fā)現(xiàn)了溫特曲霉煙色變種、帚狀曲霉、具黃曲霉、埃及曲霉、臭曲霉、日本曲霉原變種、局限灰曲霉等多種曲霉。

六堡茶渥堆過程[7]中主要微生物有青霉、灰綠曲霉、黑曲霉、黃霉菌，其中曲霉、青霉。六堡茶在后發(fā)酵階段也有少量金黃色散囊菌出現(xiàn)。

四川康磚茶[8]中還發(fā)現(xiàn)了放線菌屬以及耐高溫的葡萄球菌屬和毛霉屬。

茯磚茶制造過程中有一個獨特的“發(fā)花”工序，產(chǎn)生大量金黃色的閉囊殼，研究表明[9]，其渥堆中主要微生物有冠突散囊菌、間型散囊菌、匍匐散囊菌、謝瓦散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌、赤散囊菌、散囊菌、黑曲霉、毛霉、擬青霉、草酸青霉、短密青霉、謝瓦氏曲霉、冠突曲霉等。

1.2 黑茶中主要優(yōu)勢菌的作用研究

眾多的研究表明[5,6,10]：黑曲霉能產(chǎn)生 20種左右的水解酶，其中可利用的糖苷酶、果酸酶、葡萄糖淀粉酶、纖維素酶、柚苷酶、乳酸酶、葡萄糖氧化酶等許多酶類，還可以分解包括多糖、脂肪、蛋白質(zhì)、果膠、天然纖維和不可溶性化合物等有機物；并且它的異變菌可產(chǎn)生草酸、檸檬酸、葡萄糖酸、抗壞血酸等。青霉在渥堆過程中產(chǎn)生多種酶及有機酸，可產(chǎn)生葡萄糖氧化酶或葡萄糖酸、檸檬酸、檸檬酸霉素、抗壞血酸等；產(chǎn)黃青霉代謝產(chǎn)生的青霉素對雜菌、腐敗菌可能有良好的消除和抑制生長作用。酵母菌類主要是產(chǎn)生酒精和產(chǎn)酯等生香酵母，有機物經(jīng)酵母菌發(fā)酵后蛋白質(zhì)、維生素A等物質(zhì)的生物活性都會大幅度提高；酵母菌含有豐富的酶系統(tǒng)，如蔗糖酶、麥牙糖酶等以及生理活性物質(zhì)，如輔酶I、輔酶A等；還能利用多種糖類代謝產(chǎn)生維生素B1、B2、C等。根霉屬類具有多種酶系，它除了能分泌淀粉酶外，還能分泌酸性蛋白酶、酒化酶及乳酸、琥珀酸等；其淀粉酶的活力很高，能產(chǎn)生有機酸，如反丁烯二酸、乳酸、琥珀酸等，還能產(chǎn)生芳香的酯類物質(zhì)，賦予產(chǎn)品獨特的風味。冠突散囊菌[11]產(chǎn)生各種胞外酶（如多酚氧化酶、果膠酶、纖維素酶、蛋白酶等），作為有效的生化動力，催化茶葉中各種相關(guān)物質(zhì)發(fā)生氧化、聚合、降解、轉(zhuǎn)化。從這些研究結(jié)果中，我們可以看出黑茶發(fā)酵過程中微生物的參與起了決定性的作用，參與黑茶發(fā)酵的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性是十分復雜多樣的，對黑茶發(fā)酵的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的分析研究顯然是一個必須的選擇。

2 黑茶微生物類群多樣性研究現(xiàn)狀

目前，微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的方法主要有培養(yǎng)基培養(yǎng)分離方法、群落水平生理學指紋方法[12]、生物標記物方法[13]、現(xiàn)代分子生物學方法主要包括有群落水平總DNA分析方法[14]，核酸雜交技術(shù)[15]，克隆文庫方法[16]和基因指紋技術(shù)[17]等，方法眾多，不能一一列舉，但真正應用到黑茶微生物多樣性相關(guān)研究還很少，文獻檢索表明，絕大多數(shù)的黑茶微生物研究主要集中在黑茶樣品中微生物的分離、鑒定、微生物群落的簡單種類組成等方面，主要的分離方法是將定量樣品接種于特定的培養(yǎng)基中，在一定的溫度下培養(yǎng)一定的時間，然后對生長的菌落計數(shù)和計算含量，并通過在顯微鏡下觀察其形態(tài)構(gòu)造，結(jié)合培養(yǎng)分離過程生理生化特性的觀察鑒定種屬分類特性。顯然，培養(yǎng)基培養(yǎng)分離方法采用配比簡單的營養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用影響，這種人工環(huán)境與原生境偏差使得可培養(yǎng)種類大大減少（僅占環(huán)境微生物總數(shù)的 0.1%～10%[18]）。而且，此方法繁瑣耗時，不能用于監(jiān)測黑茶發(fā)酵過程中微生物種群結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。對黑茶中微生物的多樣性和相互作用研究遠還只是起步。眾多的群落水平生理學指紋、生物標記物、DNA分析方法等在黑茶微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究中，盡管可同時分析多個樣品，快速直觀，適合于研究微生物，分析微生物群落的結(jié)構(gòu)組成與動態(tài)變化，但還遠未發(fā)揮應有的作用。

3 黑茶發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究的思考

3.1 研究對象的零碎性

黑茶的生產(chǎn)過程中微生物的生命活動和代謝產(chǎn)物是黑茶品質(zhì)形成的重要因子。目前關(guān)于黑茶的微生物研究，大多是隨機采樣，就地取材[1,3]，對微生物的物種鑒定缺乏嚴謹，難免產(chǎn)生菌種鑒定的錯誤，而且在黑茶渥堆中特有的微生物群落的研究，主要集中在用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)、分離、鑒定方法研究其菌落組成，對黑茶的整個發(fā)酵流程的不同工藝時期、不同種類、不同產(chǎn)地黑茶品質(zhì)形成過程中的優(yōu)勢菌和非優(yōu)勢菌共同組成的渥堆中特有的微生物群落結(jié)構(gòu)的研究是零碎的、不系統(tǒng)的。由于黑茶微生物的群落結(jié)構(gòu)及其多樣性與黑茶的品質(zhì)密切相關(guān)，只有系統(tǒng)地對各地黑茶生產(chǎn)中的微生物進行研究，才能全面揭示微生物對黑茶品質(zhì)的影響。因此，需進一步加強對黑茶微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的基礎(chǔ)研究，揭示微生物在黑茶后發(fā)酵過程中的作用及機理，為黑茶的規(guī)范化生產(chǎn)和黑茶群體品牌的構(gòu)建提供科學基礎(chǔ)。為此，在全面采集和系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，建立黑茶后發(fā)酵微生物庫，對于黑茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

3.2 研究對象的片面性

在微生物對黑茶品質(zhì)形成的研究方面，對黑曲霉、酵母菌、灰色鏈霉菌、粉紅色鏈霉菌、臭曲霉等幾類優(yōu)勢菌株雖有一些報道[5,6,8,9]，但只是針對其代謝條件、產(chǎn)物、作用等方面孤立的報道，均不夠深入和系統(tǒng)?；谖⑸锏娜郝浣Y(jié)構(gòu)和多樣性特征，除進一步加強從分子水平上研究優(yōu)勢菌的作用機理外，還應對在數(shù)量上占中等、甚至微量的微生物群落進行整體研究，特別是注意研究微生物群落結(jié)構(gòu)對黑茶品質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及其機制，對于揭示黑茶風味的物種基礎(chǔ)，進行黑茶的規(guī)范化工業(yè)生產(chǎn)均具有重要的意義。然而，這方面的研究還很少，這就使得對整個黑茶的生產(chǎn)控制缺乏必要的科學根據(jù)，成為黑茶產(chǎn)業(yè)規(guī)范化生產(chǎn)主要的限制因素之一。

3.3 研究手段的單一性

目前黑茶中微生物的種類研究、微生物的功能作用研究等研究成果的取得，幾乎都是靠傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)鑒定等較為簡單和初級的研究方法[4]，顯然難以適應黑茶研究發(fā)展的需要。群落水平生理學指紋方法、生物標記物方法、現(xiàn)代分子生物學方法等目前較為成熟的研究技術(shù)還為真正應用到黑茶微生物發(fā)酵研究中來。這些方法在環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究方面有較為成功的經(jīng)驗，在黑茶發(fā)酵的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究中借鑒和引入新的成熟的研究方法是推動黑茶飛躍發(fā)展的必由之路。筆者認為，目前黑茶發(fā)酵的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究的單一性主要表現(xiàn)在兩個方面，一是只是對可培養(yǎng)分離的微生物進行研究，對于目前還不可培養(yǎng)的微生物的研究目前還是一個空白。二是研究手段單一，未能進行各種方法的有效組合進行研究。

4 結(jié)束語

當然，每一類微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性方法都有自身的功能和局限性，也都在發(fā)展和完善當中，并相互補充相互推動。傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法積累了種群分類的大量數(shù)據(jù)，為生物標記物方法和現(xiàn)代分子生物學技術(shù)提供了良好的背景材料（例如用作標準品或分子工具），在功能特性的認識上有獨特的優(yōu)勢。生物標記物方法可快速進行單個微生物樣品的群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析，但在定性上依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法。現(xiàn)代分子生物學提高了分析的靈敏度，在基因水平上擴大了物種多樣性的視野，其中基因指紋技術(shù)可同時分析多個樣品，直觀顯示了種群結(jié)構(gòu)變化情況，有助于分析調(diào)控因子對群落結(jié)構(gòu)和群落功能的影響。總而言之，加強黑茶后發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的系統(tǒng)研究，闡明微生物在黑茶生產(chǎn)中的作用及其機理，開發(fā)黑茶，是實現(xiàn)黑茶的規(guī)范化生產(chǎn)，構(gòu)建群體品牌，形成黑茶特色產(chǎn)業(yè)，并促進可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵所在。

為了能夠達到指導和調(diào)控黑茶發(fā)酵過程中微生物功能的發(fā)揮，獲得黑茶應有的品質(zhì)，黑茶微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析研究技術(shù)的發(fā)展趨勢必然是原位、快速、靈敏、高通量和準確定量。

[1]金冬雙,龔淑英.黑茶的微生物作用研究進展.茶葉,2007,33(4):203-207.

[2]楊撫林,鄧放明,趙玲艷,等.茯磚茶發(fā)花過程中優(yōu)勢菌的研究進展.茶葉科學技術(shù),2005(1):4-7.

[3]楊撫林,鄧放明,趙玲艷,等.黑茶微生物學研究進展.微生物學雜志,2006,26(1):81-84.

[4]溫瓊英,劉素純.黑茶渥堆(堆積發(fā)酵)過程中微生物種群的變化.茶葉科學,1991(11):10-16.

[5]周紅杰,李家華,趙龍飛,等.渥堆過程中主要微生物對云南普洱茶品質(zhì)形成的研究.2004,24(3):212-218.

[6]陳可可,張香蘭,朱宏濤,等.曲霉屬真菌在普洱茶后發(fā)酵中的作用.云南植物研究,2008,30(5):624-628.

[7]廖慶梅.談談六堡茶的加工技術(shù)及工藝.茶業(yè)通報,2000,22(3):30-32.

[8]付潤華,齊桂年.四川康磚的微生物學研究.江蘇農(nóng)業(yè)科學,2008(5):231-234.

[9]齊祖同,孫曾美.茯磚茶中優(yōu)勢菌群的鑒定.真菌學報,1990,9(3):176-179,16.

[10]黃振興,趙明星,阮文權(quán)等.普洱茶渥堆過程中微生物對其品質(zhì)形成的影響及其研究進展.安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(28):12496-12498,12520.

[11]黃群,陳林杰,李彥.坡冠突散囊菌黑茶發(fā)酵液對消化酶活性影響的研究.微生物學通報,2007,34(5):917-920.

[12]HAN Hui,ZHAI Zhen-hua,ZHANG Yan-yan, et al.BIOLOG analysis for fungal communities in environmental samples.Acta Ecologica Sinica,2009, 29(5):2368-2373.

[13]WERKER A G, BECKER J, HUITEMA C.Assessment of activated sludge microbial community analysis in full-scale biological wasterwater treatment plants using patterns of fatty acid isopropyl esters(FAPEs).Water Research, 2003, 37(9):2162-2172.

[14]GRIFFITHS B S, RITZ K, GLOVER L A, et al.Broad-scale approaches to the determination of soil microbial community structure:application of the community DNA hybridization technique.Microbial Ecology, 1996, 31:269-280.

[15]ANNETTE M, ULFB G.Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms.Journal of Microbiological Methods, 2000, 41: 85-112.

[16]MCCAIG A E, GLOVER L A, PROSSER J I.Molecular analysis of bacterial community structure and diversity in unimproved and improved upland grass pastures.Applied Environmental Microbi-ology,1999, 65: 1721-1730.

[17]BRUGGEMANN J, STEPHEN J R, CHANG Yun-juan, et al.Competitive PCR–DGGE analysis of bacterial mixtures an internal standard and an appraisal of template enumeration accuracy.Journal of Microbiological Methods, 2000, 40: 111-123.

[18]AMANN R I,LUDWIG W, SCHLEIFER K H.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.Microbiological Reviews,1995,59:143-169.