張 穎,楊 舸

(1.攀枝花學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,四川 攀枝花 617000;2.攀枝花學(xué)院 生物與化工研究所,四川 攀枝花 617000;3.攀枝花市食品與藥品監(jiān)督管理局,四川 攀枝花 617000)

1 雙向電泳的原理和方法

雙向電泳技術(shù)是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量?jī)蓚€(gè)相互獨(dú)立的參數(shù),在相互垂直的兩個(gè)方向進(jìn)行二次電泳的過(guò)程.首先在第一向電泳中根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)進(jìn)行等點(diǎn)聚焦(IEF),等點(diǎn)聚焦時(shí)由于各種蛋白等電點(diǎn)的不同,在高電壓場(chǎng)的作用下,蛋白質(zhì)在pH梯度膠中移動(dòng),直到取得不同的位置;然后再根據(jù)蛋白分子量的不同,在SDS-烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)中進(jìn)行第二次分離.

第一向等點(diǎn)聚焦有 3種常見(jiàn)的方法:非固相的 ISO-DALT、固相的 IPG-DALT和非平衡的NEPhGE.其中 NEPhGE主要用于分離堿性蛋白質(zhì).目前 IPG-DALT已經(jīng)取代其他兩者成為等點(diǎn)聚焦的主要手段.它的優(yōu)勢(shì)在于[1]:pH梯度穩(wěn)定,聚焦準(zhǔn)確,精度高;無(wú)陰極漂移及堿性蛋白丟失的現(xiàn)象;蛋白上樣量大,可以提高低豐度成分的分辨效果;樣品中鹽的干擾少,無(wú)邊緣效應(yīng);pH梯度和分離結(jié)果的重復(fù)性好.第二向 SDSPAGE電泳只有垂直和水平兩種形式,水平電泳可防止凝膠在染色過(guò)程中變形,因?yàn)槟z厚度減小(可至0.5mm),獲得的蛋白點(diǎn)的分辨率較高,而且可以應(yīng)用較高電壓,縮短了電泳時(shí)間從而減少蛋白擴(kuò)散[2];垂直電泳則可同時(shí)跑多塊膠,有利于應(yīng)用計(jì)算機(jī)割點(diǎn)并進(jìn)行平行差異分析,大大提高效率.現(xiàn)在國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所用的都是垂直的第二向電泳.

2 雙向電泳的主要技術(shù)步驟

2.1 樣品制備

樣品制備是雙向電泳的關(guān)鍵,主要包括蛋白溶解、變性、還原等步驟,去除鹽離子、色素、酚類和核酸等非蛋白物質(zhì),以保證順利電泳.樣本預(yù)處理的重點(diǎn)在于提高難溶蛋白的溶解度以及去除看家基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)低豐度蛋白的掩蓋作用.現(xiàn)在已有提取不同組份蛋白的試劑盒,提高了樣品處理效率和重復(fù)性,但蛋白質(zhì)的種類及特性千差萬(wàn)別,所以要想用一種“標(biāo)準(zhǔn)”的樣本溶液成分同時(shí)溶解并提取所有不同來(lái)源的樣本的蛋白幾乎是不可能的.根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的不同,可按各種屬性將蛋白分別提取,比如 Molloy等[3]用3種分別適合溶解高、中、低親水性蛋白質(zhì)的裂解液分步提取大腸桿菌蛋白質(zhì).對(duì)于低豐度蛋白的提取,可在樣本中加入蛋白酶抑制劑以防蛋白質(zhì)水解,在樣本處理中盡量富集低豐度蛋白,并采用靈敏度較高的銀染或熒光染色.

2.2 電泳(IEF/SDS-PAGE)

電泳包括 IEF、IPG膠條的平衡和 SDS-PAGE三個(gè)主要步驟.為了保證良好的電泳重復(fù)性,目前一般實(shí)驗(yàn)室 IEF通常都使用商業(yè)化的預(yù)制 IPG干膠條,可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇使用連續(xù)性或非連續(xù)性 pH梯度膠條、寬 pH梯度或窄 pH梯度膠條.平衡的作用在于充分打開(kāi)蛋白結(jié)構(gòu)中的二硫鍵,進(jìn)行蛋白的烷基化,修飾蛋白的自由巰基,阻止斷開(kāi)的二硫鍵重新形成,以便進(jìn)行下面的 SDS-PAGE.第二向 SDS-PAGE可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求采用水平和垂直兩種方式,水平膠厚度小,分辨率高,而垂直電泳體系效率高,可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)組分析.

2.3 凝膠的染色

PAGE凝膠的染色方法有很多種,主要包括有機(jī)染料染色如溴酚藍(lán)染色、氨基黑染色和考馬斯亮藍(lán)染色等,銀染,負(fù)染,膠體擴(kuò)散染料染色,膠體金屬染料染色,熒光染色,金屬螯合染料染色,放射自顯影等多種方法.目前常用的染色方法有考馬斯亮藍(lán)染色、銀染以及熒光染色等[4].考馬斯亮藍(lán)染色是經(jīng)典方法,但靈敏度較低.銀染靈敏度要高得多,但是重復(fù)性難以控制,而且對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)有干擾.熒光染色靈敏度高而且不需要染色后固定脫色等處理步驟,可以減少蛋白特別是低分子量蛋白丟失[5],缺點(diǎn)在于成本太高,而且只有含賴氨酸殘基的蛋白才能被熒光染料標(biāo)記.

2.4 圖像分析

染色后得到的雙向電泳凝膠圖譜上有大小、明暗度和位置等各不相同的蛋白斑點(diǎn),接下來(lái)的工作就是利用計(jì)算機(jī)輔助圖像軟件進(jìn)行定量分析并獲取大量有關(guān)這些蛋白斑點(diǎn)等電點(diǎn)和分子量的信息,具體操作[6]包括:數(shù)據(jù)的獲取,用圖像掃描儀、熒光測(cè)定儀等采集凝膠圖像;圖像加工,進(jìn)行背景和污點(diǎn)的校正,濾掉一部分背景及去除部分水平和垂直條紋;斑點(diǎn)檢測(cè)和定量,把凝膠上的蛋白點(diǎn)數(shù)字化,得到斑點(diǎn)面積、每點(diǎn)相對(duì)黑度等參數(shù),可根據(jù)蛋白點(diǎn)面積的大小和顏色的深淺進(jìn)行定量分析;凝膠配比,消除使圖像變形的參數(shù),將其轉(zhuǎn)變成可比較的圖像,隨后進(jìn)行配比,以得到理想的凝膠圖譜,便于分析蛋白的變化;數(shù)據(jù)分析,分析凝膠中有效蛋白斑點(diǎn)數(shù)目、強(qiáng)度飽和的斑點(diǎn)數(shù)目和配比的斑點(diǎn)數(shù)目;數(shù)據(jù)呈遞,計(jì)算每個(gè)被檢測(cè)的蛋白斑點(diǎn) Mr(分子量)/Ip(等電點(diǎn))值;建立 2-DE數(shù)據(jù)庫(kù),用前面分析的許多諸如蛋白名稱、Mr/Ip和目錄性信息以及其它文獻(xiàn)的描述性信息構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)[7].

3 雙向電泳的技術(shù)特點(diǎn)及存在問(wèn)題

3.1 分辨率

一般的雙向電泳能分辨 1 000～3 000個(gè)點(diǎn),是目前分析組份復(fù)雜蛋白分辨率最高的工具[8].雙向電泳的分離能力取決于雙向上的長(zhǎng)度,通常認(rèn)為與有效的分離面積成正比[9],對(duì)于特別復(fù)雜的樣品,要獲得最大分辨率,用特大膠可以從全細(xì)胞裂解液中分離得到 5 000～10 000個(gè)蛋白點(diǎn)[10].IPG干膠條,水平電泳,在有效范圍內(nèi)增大凝膠面積等措施都有助于提高分辨率.如利用多塊重疊范圍放大 IPG膠來(lái)生成復(fù)雜樣本的 2-DE蛋白圖譜[11]更具有明顯優(yōu)勢(shì).但細(xì)胞內(nèi)含有大約 3～5萬(wàn)種蛋白質(zhì),所以現(xiàn)有的分辨率還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足分析細(xì)胞全蛋白的需要,特別是對(duì)細(xì)胞內(nèi)的低豐度蛋白、極端酸性和堿性蛋白、分子量過(guò)大或過(guò)小蛋白、難溶蛋白等的電泳分離仍面臨很大困難.

3.2 重復(fù)性

雙向電泳的重復(fù)性一直是限制 2-DE被進(jìn)一步廣泛應(yīng)用的瓶頸所在,它關(guān)系到不同實(shí)驗(yàn)室之間數(shù)據(jù)交換和利用,也直接影響蛋白質(zhì)組研究的價(jià)值和應(yīng)用[12].以 IPG膠代替?zhèn)鹘y(tǒng)的基于兩性電解質(zhì)的等點(diǎn)聚焦,較大程度上提高了雙向電泳的重復(fù)性,但并非徹底解決.此外還可以通過(guò)省去濃縮膠,在第二向電泳中使用連續(xù)的分離膠等一些簡(jiǎn)化步驟的手段以減少操作誤差,當(dāng)然如果能將整個(gè)電泳過(guò)程實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化就能徹底消除操作誤差.

3.3 雙向電泳圖譜的信息化

將雙向電泳所得到的大量蛋白質(zhì)組圖譜用來(lái)建立蛋白質(zhì)組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù),即對(duì)數(shù)字化蛋白點(diǎn)的分布部位、斑點(diǎn)面積和灰階、背景過(guò)濾、2-DE凝膠配比,建立參考圖譜.研究者可根據(jù)自己的需要對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,找到對(duì)應(yīng)的參考圖譜進(jìn)行比對(duì)分析,只要是在極為標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟下得到的凝膠圖譜,就可以根據(jù)蛋白點(diǎn)在圖像上的位置和已知的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較來(lái)鑒定一些蛋白.現(xiàn)在國(guó)際上已有一些由權(quán)威研究所和公司開(kāi)發(fā)的公共數(shù)據(jù)庫(kù),每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)都包含了大量的信息,并且在日益完善中.比如 SWISS-2DPAGE數(shù)據(jù)庫(kù),里面有許多標(biāo)準(zhǔn)的凝膠圖像以及預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)在凝膠上位置變化的方法,可以用來(lái)比對(duì)分析以鑒定蛋白.但是由于技術(shù)上的差異(樣本制備、IEF、SDS-PAGE、染色等)使每個(gè)實(shí)驗(yàn)室得到的蛋白質(zhì)組圖譜都不完全一樣,這就給資源共享帶來(lái)了很大困難,但隨著操作技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化及自動(dòng)化的逐步實(shí)現(xiàn),信息資源的完全共享將成為可能.

3.4 雙向電泳的技術(shù)缺陷

樣本中實(shí)際蛋白濃度差可能達(dá)到 1000 000倍,而雙向電泳最多只能顯示 100倍的蛋白濃度差.雙向電泳只適合用來(lái)分析高豐度范圍的蛋白質(zhì),為了得到有意義的結(jié)果及提高分辨率,制備純的蛋白質(zhì)組(95%～99%)是必要的,而且由于生物質(zhì)譜技術(shù)的高敏感性,如果蛋白質(zhì)組被污染,將會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)組被錯(cuò)誤地注釋,這就給操作帶來(lái)了難度.另外許多蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)技術(shù)都不是定量的(例如質(zhì)譜技術(shù)),或者只在一定范圍內(nèi)定量(例如銀染和考馬斯亮藍(lán)染色),這就使定量地研究蛋白質(zhì)表達(dá)的正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)變得很困難,差異凝膠電泳和同位素代碼標(biāo)記的出現(xiàn),對(duì)以雙向電泳為核心的傳統(tǒng)方法提出了創(chuàng)新和改進(jìn),為解決這個(gè)問(wèn)題指出了一個(gè)方向.

4 雙向電泳的發(fā)展前景

雙向電泳技術(shù)當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn):1)提高蛋白的溶解度和染色的靈敏度.2)低豐度蛋白以及難溶性蛋白的分離.3)在不影響分辨率的前提下提高上樣量以提高 2-DE凝膠圖像的分析和數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)性能.4)缺乏靈敏可靠的蛋白檢測(cè)手段和定量方法.5)極酸或極堿蛋白以及分子量極大或極小的蛋白的分離.6)要得到高質(zhì)量的凝膠圖像需要高度標(biāo)準(zhǔn)化的操作.

隨著雙向電泳技術(shù)體系的進(jìn)一步發(fā)展,會(huì)不斷出現(xiàn)新的樣本處理方法、染色方法以及經(jīng)過(guò)改進(jìn)的電泳方法.例如目前流行的雙向差異凝膠電泳(Two-dimensional different gelelectrophoresis,2-D DIGE)通過(guò)多元分析得到更多的蛋白質(zhì)組信息,大大提高了凝膠之間的重復(fù)性和結(jié)果的可信度.

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述,雙向電泳的分辨率高,但重復(fù)性有待加強(qiáng),蛋白質(zhì)圖譜資源有待共享化.雖然受到許多其他新技術(shù)的挑戰(zhàn),但其對(duì)于分離檢測(cè)細(xì)胞、細(xì)胞系、器官和組織的總蛋白質(zhì)組是最有效的方法之一,同時(shí)與其他蛋白質(zhì)組研究技術(shù)(如生物質(zhì)譜技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)復(fù)合物純化技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)等)互補(bǔ)長(zhǎng)短,一起為解決這個(gè)領(lǐng)域的諸多問(wèn)題發(fā)揮巨大作用.

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