金 錚,于金錄,楊 ,李 超,黃海燕

(吉林大學第一醫(yī)院神經(jīng)外科,吉林長春 130021)

膠質(zhì)瘤來源exosome的鑒定及其蛋白質(zhì)組成研究

(吉林大學第一醫(yī)院神經(jīng)外科,吉林長春 130021)

目的初步分析膠質(zhì)瘤細胞分泌的exosome蛋白組成,探討膠質(zhì)瘤來源exosome的潛在免疫調(diào)節(jié)功能,從而為進一步利用exosome對膠質(zhì)瘤進行免疫治療提供理論依據(jù)。方法采用差速離心法從U251膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清液和Ⅲ級星形膠質(zhì)瘤囊液中分別提純exosome,用透射電鏡鑒定;利用二維電泳分離、分析exosome內(nèi)蛋白質(zhì),并用質(zhì)譜技術鑒定了部分蛋白質(zhì)。結(jié)果膠質(zhì)瘤細胞可以產(chǎn)生exosome,其平均直徑約100 nm。二維電泳圖顯示U251細胞分泌的exosome含有270個蛋白點,與數(shù)據(jù)庫相符的有66個;而來自Ⅲ級星形膠質(zhì)瘤囊液的exosome含有242個蛋白點,與數(shù)據(jù)庫相符的有60個;兩者有130個蛋白點在等電點和表觀分子量方面相同,其中包含HSP70、RNA結(jié)合蛋白、核酸外切酶、MHCI及MHCII類分子等。部分蛋白質(zhì)點質(zhì)譜鑒定結(jié)果為hCG、低密度脂蛋白、T細胞受體等。結(jié)論膠質(zhì)瘤細胞可分泌exosome,其一般特性與已報道的exosome一致,其蛋白組成與其他細胞來源的exosome具有共性,體內(nèi)和體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞分泌的exosome的蛋白質(zhì)組成具有同源性與差異性。膠質(zhì)瘤細胞源的exosome具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能,可以為膠質(zhì)瘤免疫治療提供理論基礎。

exosome;膠質(zhì)瘤;蛋白質(zhì)組學;雙向凝膠電泳;質(zhì)譜

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1386)

Exosome起源于細胞內(nèi)晚期核內(nèi)體(late endosomes,LEs),即多泡體(multivesicular bodies,MVB)。Exosome似的小囊泡在多泡體內(nèi)積聚,當多泡體的外膜與細胞質(zhì)膜融合后,其內(nèi)的小囊泡批量地釋放到細胞外基質(zhì)中,從而形成exosome。Exosome的功能根據(jù)來源細胞的不同而有所不同,其中腫瘤來源的exosome[1]是目前研究的熱點,由于其攜帶腫瘤抗原,而且腫瘤細胞容易培養(yǎng),因此它是一種理想的可能用于臨床的exosome。在免疫系統(tǒng)中,exosome能夠?qū)⑼鈦砜乖瓊鬟f給T細胞,在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。它也可作為一種免疫治療的新手段,應用在腫瘤治療和免疫耐受等方面。

因此,關于exosome的蛋白質(zhì)研究成為目前亟待解決的問題。本實驗首次用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析的方法對U251膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清液和Ⅲ級星型膠質(zhì)瘤囊液中提純的exosome的蛋白質(zhì)進行分離并鑒定,為膠質(zhì)瘤細胞來源exosome的功能研究提供理論依據(jù),也為exosome應用于臨床治療打下基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

IPGphor等點聚焦電泳儀、圖像掃描儀、恒溫循環(huán)器、Image Master VDS掃描軟件、image master 2D platinum Image Quant TL凝膠圖譜分析軟件(瑞典Amersham Pharmacia Biotech);PROTEAN II Xi Cell垂直電泳儀購自BIO-RAD公司。

固相 pH 梯度干膠條 pH3-10、SDS、DTT、Acr、IPG-Buffer等購自Amersham-Pharmacia公司;硫脲、無水醋酸鈉、硝酸銀等均為國產(chǎn)分析純或色譜純;水為MilliQ超純水。

1.2 實驗材料及來源 U251膠質(zhì)瘤細胞購自中國科學院上海細胞庫;Ⅲ級星形膠質(zhì)瘤細胞囊液(膠質(zhì)瘤患者囊液,吉林大學第一醫(yī)院)。

1.3 實驗分組

A組:U251膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清液;

B組:為對照組,DMEM培養(yǎng)液,無細胞成分。

C組:Ⅲ級星形膠質(zhì)瘤細胞囊液(膠質(zhì)瘤患者囊液);

1.5 蛋白樣品制備

-80℃保存樣品,臨用前取出,以1∶10體積加入500 μ l裂解液,同時按照50∶1的比例加入cocktail蛋白酶抑制劑10 μ l;超聲破碎組織,每次超5 s停15 s,至 樣品完全 溶解為透 明 、澄 清 ;加 入 10 μ g?μ l-1DNA、RNA 酶 5 μ l;冰浴 20 min;4℃ 14 000 rpm 高速離心20 min;吸取上清,分裝,-80℃保存。

裂解液成分 :40 mmol?L-1Tris-HCl、7 mol?L-1尿素 、2 mol?L-1硫脲 、4%CHAPS 、1%DTT 、1 mmol?L-1EDTA。采用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。

1.6 雙向凝膠電泳

用IPGphor IEF System進行第一相等電聚焦,蛋白上樣前離心2 min,上樣100 μ g,用重泡脹液溶解,其中含 8 mol?L-1尿素 、0.02%CHAPS 、0.02 mol?L-1DTT 、0.05%IPG buffer,加入 800 μ l覆蓋液 。 等電聚焦程序設置,見表1。

表1 等電聚焦程序設置

第一相等電聚焦結(jié)束后,迅速拿出膠條在SDS平衡液中平衡兩次,搖床上振蕩15 min×2,其中第一種平衡液中加入20 mmol?L-1DTT,第二種平衡液中加入100 mmol?L-1碘乙酰胺。

取出膠條在PROTEN II xi Cell上進行第二相垂直SDS-PAGE,用濃度為13%的聚丙烯酰胺凝膠分離。恒流40 mA 40 min、60 mA 5 h,直至溴酚藍前沿到達玻璃板底部。

凝膠采用考馬斯亮藍染色。

1.7 圖像分析

應用瑞典Amersham pharmacia Biotech公司的圖像分析軟件image master 2D platinum對結(jié)果進行分析。查閱exosome蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,具體操作為:登陸www.expasy.org,輸入關鍵詞 exosome,在 Swiss-Prot和TrEMBL中搜索結(jié)果。分別查閱蛋白質(zhì)等電點及分子量,然后將TrEMBL結(jié)果同樣本A所得結(jié)果進行比對。

1.8 膠內(nèi)酶解和質(zhì)譜分析

從2DE膠上切取差異蛋白點,用50 mmol?L-1的NH4HCO3,(含5 mmol?L-1CaCl2)配成 0.1 g?L-1的溶液置于冰浴中;每管抽干的膠塊中加入約10 μ l酶液讓其膠塊吸收,吸干后再加,置于冰浴中 45 min;膠塊吸脹后將多余酶液吸去,再加入20 μ l不含酶的緩沖液覆蓋,37℃過夜消化;酶解后上清液用Tip頭移至另一新的EP管,剩下的膠用50 μ l萃取液(5%TFA:50%CAN=1∶1)萃取 2次,每次超聲 10 min;合并萃取液凍干后備用。

制備好的樣品用MALDl-TOF質(zhì)譜分析。應用Mascot搜索引擎進行蛋白比對,結(jié)合NCB Inr和Swissprot數(shù)據(jù)庫進行綜合分析。

2 結(jié)果

2.1 雙向凝膠電泳結(jié)果

經(jīng)掃描共獲得3幅雙向凝膠電泳圖像(圖略)。經(jīng)2DE分離蛋白組成,并用軟件分析凝膠圖譜后發(fā)現(xiàn),exosome蛋白含量豐富,U251膠質(zhì)瘤細胞分泌的exosome含有270個蛋白點;而Ⅲ級星形膠質(zhì)瘤囊液源exosome含有242個蛋白點;兩者有130個蛋白點等電點和表觀分子量相同。胎牛血清僅有109蛋白點。

2.2 雙向凝膠電泳結(jié)果分析

查閱蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,對 2DE結(jié)果進行分析。Swiss-Prot中有99個結(jié)果,TrEMBL中有212個結(jié)果。分別查閱其等電點及分子量,將TrEMBL結(jié)果同樣本A、C組所得結(jié)果進行比對,exosome蛋白含量豐富,U251膠質(zhì)瘤細胞分泌的exosome含有270個蛋白點,與數(shù)據(jù)庫相符的有66個;而Ⅲ級星形膠質(zhì)瘤囊液源exosome含有242個蛋白點,與數(shù)據(jù)庫相符的有60個;兩者有130個蛋白點等電點和表觀分子量相同。 依次查詢 HSP70、MHCI、MHCII、CT antigen 和VEGF,并與樣本A、C所得結(jié)果進行對比,發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細胞源性exosome含有RNA結(jié)合蛋白、核酸外切酶、HSP70、MHCI及MHCII類分子。

2.3 質(zhì)譜分析結(jié)果

分別選取U251細胞(圖略)和Ⅲ級星型膠質(zhì)瘤囊液(圖略)的2DE考染的部分蛋白質(zhì)做質(zhì)譜分析,共鑒定出17個蛋白質(zhì):點6、7、11均被鑒定為低密度脂蛋白受體,點8被鑒定為E1-E2 ATPase,點9被鑒定為T細胞受體β鏈(TCRBV6S3J2S6 gene),點10被鑒定為真核翻譯起始因子3,點12和14分別被鑒定為免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū),點37被鑒定為人免疫球蛋白g1Fc段的晶體結(jié)構(gòu),點13被鑒定為循環(huán)B細胞抗體重鏈可變區(qū),點15被鑒定為維生素K環(huán)氧化物還原酶復合物1亞單位2號單體,點31被鑒定為1號染色體142位開放閱讀框,點32被鑒定為甲狀腺激素蛋白穩(wěn)定物,點34被鑒定為HCG,點35被鑒定為核苷酸交換因子,點36被鑒定為維生素D結(jié)合蛋白前體,點38被鑒定為乙二醛酶結(jié)構(gòu)蛋白4,點4、5、33均鑒定為一種假定蛋白,點30為一未命名蛋白。

3 討論

本實驗首次采用蛋白組學技術對膠質(zhì)瘤源性exosome進行研究,通過雙向凝膠電泳將膠質(zhì)瘤源性exosome進行蛋白質(zhì)分離,掃描制備凝膠圖像,查閱蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,對電泳結(jié)果進行分析,查找出一些可疑蛋白質(zhì)。并對部分蛋白點進行了質(zhì)譜鑒定,確定了其蛋白質(zhì)名稱,從而為exosome的抗膠質(zhì)瘤治療提供基礎理論依據(jù)。

通過雙向凝膠電泳結(jié)果與exosome蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對比顯示,膠質(zhì)瘤細胞源性exosome含有HSP70、RNA結(jié)合蛋白、核酸外切酶、MHCI及MHCII類分子等。

細胞外的熱休克蛋白70(Heat Shock Proteins70,HSP70)具有免疫調(diào)節(jié)功能,并且在激活天然免疫系統(tǒng)活性的過程中起重要作用。液相中的HSP 70可使單核細胞通過CD14依賴性信號通路分泌促炎癥細胞因子[2,3];質(zhì)膜上結(jié)合的HSP 70被確認為是由自然殺傷細胞調(diào)節(jié)的溶細胞作用的目的蛋白。而且,腫瘤細胞膜上HSP70表達度越高,腫瘤細胞被自然殺傷細胞(natural killer cell,NK細胞)殺傷的幾率越大,抗腫瘤效果越明顯[4,5]。另外,用液相HSP70與NK細胞共孵育后,可以進一步增強NK細胞的溶細胞活性,并促進IFN-γ的分泌。HSP70表面陽性的exosome也可以選擇性激活NK細胞,使其遷移、增殖,并產(chǎn)生免疫反應[6]。腫瘤細胞源性的exosome攜帶了大量的具有免疫調(diào)節(jié)功能的熱休克蛋白,可在不用探明具體腫瘤抗原的情況下,進行腫瘤免疫治療。不同的實驗證明,經(jīng)HSP激活的免疫細胞可以消除不同的腫瘤,并且目前腎臟腫瘤和轉(zhuǎn)移黑色素瘤的免疫治療已進入三期臨床試驗。腫瘤細胞源exosome富于HSP70分子伴侶,有可能會成為腫瘤免疫治療的新熱點。

質(zhì)譜鑒定的部分蛋白質(zhì)為低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR),人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG),T細胞受體,E1-E2 ATPase,真核翻譯起始因子,維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體1(vitamin K epoxide reductase complex subunit 1,VKORC1)等。

LDLR廣泛分布于肝、動脈壁細胞等全身各組織的細胞膜的表面。其主要功能是調(diào)節(jié)膽固醇的體內(nèi)平衡[7]。近來有人發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細胞的LDLR的表達量顯著增高[8],因而考慮LDLR可作為抗腫瘤藥物靶向給藥的靶點。LDLR介導的靶向給藥方式并不能獲得完全的腫瘤細胞特異性,因為正常細胞也表達LDLR,動物實驗表明,若事先用膽汁酸和甾體化合物處理動物可能會緩解這一矛盾[8]。因此對LDLR表達、功能及其影響因素的關注,已成為近年來研究的一大熱點。

正常的hCG主要功能是維持妊娠黃體,使胚胎得以發(fā)育,從而維持到足月妊娠,胎兒得以分娩。近些年很多學者發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤可以表達異位hCG,但機理尚未清楚,多數(shù)學者[9-11]認為這是由于成人細胞的胚胎基因的不完全抑制,當發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化時,靜息的胚胎基因被激活而表達。腫瘤組織分布的一定濃度的分泌性hCG可能與腫瘤微環(huán)境的形成有一定的關系。雖然關于異位hCG與惡性腫瘤之間的關系已經(jīng)有了較多的研究,然而國內(nèi)尚未有膠質(zhì)瘤分泌異位hCG的報道,我們此次研究通過質(zhì)譜分析認為膠質(zhì)瘤源性exosome中含有hCG家族蛋白。

膠質(zhì)瘤來源的exosome在對抗膠質(zhì)瘤的作用過程中能夠起到一定的免疫調(diào)節(jié)作用。當然,除HSP70以外,exosome內(nèi)還表達MHCI分子[12-14]、以及 B7[12,15]、ICAM[12,16]、CD40[12]等共刺激分子 ,這些分子的表達對于抗原提呈,增強免疫效應也起著舉足輕重的作用[17]。但是,膠質(zhì)瘤細胞來源的exosome蛋白成分復雜,具體在免疫治療過程中起什么作用及效果,還有待于進一步的研究。

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Identification and research of protein composition of exosome from glioma cell

JIN Zheng,YU Jin-lu,YANG Si,et al.(Department of Neurosurgery,The First Hospital of Ji Lin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo preliminary analyse of protein composition of exosome secreted by glioma,to explore the potential immunoloregulationof exosome from glioma cell,so as to make further use of exosome treatment of provideing a theoretical basis for glioma immunotherapy.MethodsPurified exosome from the supernatant of culture fluid of U251 glioma cell and hydatid fluid of grade III astroglioma cell by differential centrifugation,identified by transmission electron microscopy;analysis the protein composition of exosome by 2DE,identified the protein composition of exosome by mass spectrometry.ResultsGlioma cell can secrete exosome,the average diameter of the exosome is about 100 nm.Two-dimensional electrophoresis diagram shows that the exosome secreted by U251 glioma cell containing 270 protein spots,whit 66 proteinspotsmatch the database;the exosome secreted byⅢgrade astrocytoma cyst fluid containing 242 protein spots,whit 60 protein spotsmatch the database;the isoelectric point and apparent molecularweight of 130 protein spots are identical of the two kinds exosome,which contains HSP70,RNA-binding protein,exonuclease,MHCI,MHCII and so on.Part of the protein spotsidentified by mass spectrometry results of hCG,low-density lipoprotein,T cell receptor and so on.ConclusionGlioma cells can secrete exosome,itsgeneral characteristics in line with the reported exosome,its protein composition is common with other cell secreted exosome,the protein composition of exosome which secreted by glioma in vivo and in vitro have homologous and variability.Exosome secreted by glioma has a potential immunoloregulation function,can provide a theoretical basis of glioma immunotherapy.

exosome;glioma;proteomics;2D-PAGE;mass spectrogram

R739.4

A

1007-4287(2010)09-1386-04

*通訊作者

2010-01-15)