鄧 健,馬艷霞,郭娜娜,李瑞芳,李 杰,史宇輝,郭瑞玲

(1.邯鄲市疾病預(yù)防控制中心,河北 邯鄲 056008;2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部)

邯鄲市乙型肝炎基因分型及其臨床意義研究

鄧 健1,馬艷霞1,郭娜娜1,李瑞芳1,李 杰2,史宇輝2,郭瑞玲1

(1.邯鄲市疾病預(yù)防控制中心,河北 邯鄲 056008;2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部)

目的研究不同類型乙型肝炎病毒(HBV)感染者中HBV基因型分布情況及其臨床意義。方法應(yīng)用基因型特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR),對180份HBV感染者血清進(jìn)行基因型分型。結(jié)果180份標(biāo)本中,162份(90%)可檢出基因型,18份(10%)未檢出基因型。162份HBV基因型分布為:B基因型1例(0.6%),C基因型159例(98.1%),B+C混合基因型2例(1.2%),未檢出A、D、E、F基因型。結(jié)論邯鄲地區(qū)HBV感染者中,基因型分布較單一,C基因型占絕對優(yōu)勢,同時(shí)存在少量B基因型及B+C混合基因型,C基因型可能與較嚴(yán)重的肝臟病變有關(guān)。

乙型肝炎病毒;基因型;聚合酶鏈反應(yīng)

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0059)

1988年Okamoto等[1]第一次發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的血清亞型將被不同乙型肝炎病毒(HBV)毒株的基因亞組所取代,他們通過比較18株乙型肝炎病毒的全部核苷酸序列后,根據(jù)異源性≥8%或同源性＜92%,將其分為4個(gè)基因型,從而初步建立了基因分型體系。迄今為止,乙型肝炎病毒可分為A-H 8種基因型。研究發(fā)現(xiàn),乙肝病毒的基因型呈地域性分布,不同的基因型致病性不同,且預(yù)后差異較大[2-5]。作者利用巢式PCR方法調(diào)查邯鄲市乙肝病毒的基因型,為預(yù)防及治療乙型肝炎提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標(biāo)本 共采集血清標(biāo)本180份,其中,急性乙型肝炎7例,無癥狀攜帶者3例,慢性乙型肝炎119例,肝硬化30例,肝細(xì)胞癌21例。診斷符合2000年“病毒性肝炎防治方案”標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 試劑和儀器 核酸提取試劑盒購自美國Promega公司;dNTP和Taq DNA聚合酶購自上海生工生物技術(shù)公司;瓊脂糖、DNA分子量標(biāo)志phiX174DNA/HaeⅢ、HBeAg檢測試劑盒購自上海華美生物工程公司。臺(tái)式高速離心機(jī)為德國Heraeus公司Biofuge 28R5,PCR熱循環(huán)儀和凝膠成像儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成,序列見表1。

表1 HBV基因分型引物及序列

1.2 方法

1.2.1 PCR法對HBV DNA基因型分型 HBV DNA提取按照美國Promega公司試劑盒說明書操作。HBV基因型及基因亞型檢測的詳細(xì)步驟參見文獻(xiàn)[6]。采用多對引物和巢式PCR法擴(kuò)增前S和S基因區(qū)進(jìn)行HBV基因分型。HBV各基因型PCR產(chǎn)物大小為:A基因型為68 bp,B基因型為281 bp,C基因型為122 bp,D基因型為119 bp,E基因型為167 bp,F基因型為97 bp。

1.2.2 HBeAg的檢測 應(yīng)用上海華美生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒檢測,嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 電泳結(jié)果 根據(jù)PCR產(chǎn)物片斷長度大小,觀察電泳條帶區(qū)分基因型(圖1)。

2.2 HBV感染者基因檢測結(jié)果 180份標(biāo)本中,162份(90%)可檢出基因型,18份(10%)未檢出基因型。162份HBV基因型分布為:B基因型1例(0.6%),C基因型 159例(98.1%),B+C混合基因型2例(1.2%),未檢出A、D、E、F基因型 。

2.3 HBeAg檢測結(jié)果 180份標(biāo)本中39份(21.7%)陽性,141份(78.3%)陰性。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

2.4.1 不同類型HBV感染者基因型分布:18份(10%)未檢出基因型者分布在急性肝炎組6例,無癥狀攜帶組3例,慢性肝炎組9例。HBV基因型在不同類型HBV感染者中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,2例B+C基因型分別分布在肝硬化組和慢性肝炎組,1例B基因型在慢性肝炎組。

2.4.2 HBeAg陽性和陰性感染者中基因型分布:1例B基因型和2例B+C基因型均在HBeAg陰性感染組。

圖1 B、C基因型電泳圖

3 討論

HBV基因型分布有明顯的地域特征。基因A型分布于西北歐、北美和非洲,B、C型分布于亞洲,D型分布于地中海、中東地區(qū)和印度[7]。我國的HBV基因型以B、C型為主[7、8],其中北方以C型占絕大多數(shù),而南方則以B型為主,新疆以D型多見。

近年來的研究表明,不同的基因型與HBV感染的致病性有一定的相關(guān)性。C基因型在重癥乙型肝炎患者中為優(yōu)勢基因型[5、9-10],B基因型在無癥狀HBV攜帶者中比例較高,約占72.2%[6]。通過對B、C型慢性肝炎患者ALT、AST、TBIL、G 等比較,結(jié)果顯示C型肝臟損害明顯比B型嚴(yán)重,同時(shí)根據(jù)研究結(jié)果可知C型肝炎后肝硬化的發(fā)生率比B型高;C型肝細(xì)胞癌的發(fā)病率較B型高[11]。Lindh[12]等對HBV慢性感染者的基因型及C基因啟動(dòng)子(CP)變異的研究表明,T1762變異更易出現(xiàn)在C基因型,感染C型后更易出現(xiàn)較重的肝臟炎癥。Kao[13]等在臺(tái)灣做了一個(gè)較大樣本的調(diào)查,發(fā)現(xiàn)C基因型在肝硬化及年齡大于50歲的病人中的流行率顯著高于無癥狀攜帶者;年齡分層分析顯示,35歲以下的肝癌病人中B型的感染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無癥狀攜帶者;另外,C基因型感染率隨年齡的增長而下降。說明c基因型要經(jīng)過較長時(shí)間的免疫清除然后進(jìn)入較嚴(yán)重的肝臟損害階段,而B基因型則經(jīng)過較短的免疫清除進(jìn)入較輕的病變階段。從目前的研究來看,HBV C基因型與較重的肝臟病變相關(guān),B型則與較輕的病變相關(guān)。

HBV基因型與干擾素的治療效果有關(guān),與核苷類抗病毒藥物療效的關(guān)系還不確定。趙文靜[14]等研究血清B、C型HBV感染與臨床診斷抗病毒相關(guān)性結(jié)果揭示了乙型肝炎病毒感染的基因型及不同基因型與診斷治療的相關(guān)性,及拉米夫定對B基因型的治療優(yōu)于C型。

從上述研究中可見,HBV C基因型與較重的肝臟病變相關(guān),并且藥物治療效果相對不理想;B型與較輕的病變相關(guān),并且藥物治療效果較HBV C基因型明顯。本研究結(jié)果表明,邯鄲地區(qū)HBV感染者中,基因型分布較單一,C基因型(98.1%)占絕對優(yōu)勢,同時(shí)存在少量B基因型(0.6%)及B+C混合基因型(1.2%)。由此可給乙型肝炎的臨床治療提供一定的參考依據(jù)。邯鄲地區(qū)基因型單一的原因可能與該地區(qū)居民流動(dòng)性較小有關(guān)。另外,急性乙型肝炎患者機(jī)體清除HBV作用強(qiáng),病毒量下降快,而病毒量較低時(shí)難以檢測出基因型,故本研究中的急性乙型肝炎標(biāo)本可檢出結(jié)果者較少。對慢性HBsAg攜帶者和急性乙型肝炎,還需進(jìn)一步增加病例樣本,以闡明邯鄲地區(qū)HBV基因型和亞型的分布規(guī)律。

[1]Okamoto H,Tsuda F,Sakugawn H,et al.Typ ing hepatitis Bvirus by homology in nucleotide sequence:comparison of sur2face antigen subtypes[J].J Gen Virol,1988,69(Pt 10):2575.

[2]Chan HL,Tsang SW,L iew CT,et al.Viral genotype andhepatitis B virus DNA levels are correlated with histologicalliver damage in HBeAg2negative chronic hepatitisB virus infection[J].Am J Gastroenterol,2002,97(2):406.

[3]孟運(yùn)運(yùn),種紅云,王耀峰.原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的乙型肝炎病毒基因分型研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2007,12(06):435.

[4]于紅纓,邵凌云,符政遠(yuǎn),等.湖南省懷化市少數(shù)民族及漢族慢性乙型肝炎患者病毒基因分型及臨床分析[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版),2008(01).

[5]朱崇堯,曹海燕,李紅生,等.連云港地區(qū)慢性乙型肝炎患者HBV基因型的研究[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇,2008(01).

[6]李雅娟,莊 輝,李 杰,等.乙型肝炎病毒基因型和亞型的分布及其與臨床的相關(guān)性[J].中華肝臟病雜志,2005,13(10):724.

[7]Zeng G,Wang Z,WenS,et al.Geographic distribution,virologic and clinical characteristics of hepatitis Bvirus geno2types in China[J].Journal of Viral Hepatitis,2005,12:609.

[8]宋淑靜,何忠平,莊 輝,等.中國北方5城市慢性乙型肝炎患者的基因分型[J].中國公共衛(wèi)生,2004,20(02):166.

[9]馮相偉,孟繁平,汪 楊,等.慢性乙型肝炎患者血清HBV基因分型[J].微生物學(xué)雜志,2007,2(03).

[10]唐克明,高伏圣,張春林,等.中國安徽地區(qū)肝癌組織中HBV基因型的分布研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2008(12).

[11]區(qū)映研,楊海紅,曾文鋌,等.乙肝病毒基因分型的臨床意義[J].廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,33(06):26.

[12]Lindh M,Hannoun Dhillon AP,et al.Core promoter mutations and genotypes in relation to viral replication and liver damage in East Asian hepatitis B virus carriers[J].Infect Dis,1999,179(4):775.

[13]Kao JH.Hepatitis B virus genotypes and hepatocellular carcinoma in Japan Reply[J].Gastroenterology,2001,120(3):1564.

[14]趙文靜,王波,劉微,等.吉林省血清B、C型HBV感染與臨床診斷抗病毒相關(guān)性研究[J].吉林醫(yī)學(xué),2006,27(01):26.

Distribution and clinical significance of hepatitis B virus(HBV)genotypes in HBV-infected patients in handan city

DENG Jian,MAYan-xia,G UO Na-na,et al.(Handan Center forDisease Control and Prevention,Handan056008,China)

ObjectiveTo study hepatitis B virus(HBV)genotype distribution and its clinical significance in HBV-infected patients.MethodsWe used type specific primers andPCR to detect HBV genotype of 180HBV-infected patients.ResultsAmong180 HBV-infected patients,162(90%)can detect the genotype,the other can't.in the 162,1(0.6%)was genotype B,and 2(1.2%)were genotype B+C,and 159(98.1%)were genotype C,and none wasgenotype A、D、E 、F.Conclusionamong HBV-infectedpatients in handan city,genotype C was predominant,and genotype B and genotype B+C were minor.Genotype C may be associated with the severe liver process.

Hepatitis B virus;Genotype;Polymerase chain reaction

R512.6+2

A

1007-4287(2010)01-0059-03

2009-05-11)