代雪茹,馬晟利,呂秋菊,孫 劍

(1.黑龍江省佳木斯大學(xué),黑龍江佳木斯 154001;2.黑龍江省醫(yī)院 黑龍江 哈爾濱 150001;)

血鏈球菌對(duì)牙周炎主要致病菌拮抗作用機(jī)理研究

代雪茹1,馬晟利2*,呂秋菊1,孫 劍1

(1.黑龍江省佳木斯大學(xué),黑龍江佳木斯 154001;2.黑龍江省醫(yī)院 黑龍江 哈爾濱 150001;)

*通訊作者

血鏈球菌是牙周優(yōu)勢(shì)細(xì)菌,被認(rèn)為是拮抗牙周可疑治病菌的主要有益菌[1,2]。在齦下菌斑的形成中有重要作用。血鏈球菌作為有益菌群成員之一,它對(duì)大多數(shù)牙周可疑致病菌,如牙齦卟啉單胞菌、伴放線桿菌等都具有抑制作用[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)wistar大鼠剝離牙齦及齦溝內(nèi)接種牙齦卟啉單胞菌誘發(fā)牙周炎,將血鏈球菌培養(yǎng)的活菌體對(duì)牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行拮抗,并觀察其對(duì)牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性wistar大鼠45只,體重在220 g-260 g左右,購(gòu)自佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中心。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

血鏈球菌ATCC 10556(由華西醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生部口腔微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供);牙齦卟啉單胞菌ATCC 33 277(由首都醫(yī)科大學(xué)口腔基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.3 wistar大鼠牙周炎模型建立

1.3.1 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,隨機(jī)分為2組。正常對(duì)照組15只,正常喂養(yǎng),不作特殊處理;牙周炎組30只:在喂養(yǎng)中用10%的高糖水替代飲水,動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,于第8天開始隔日給予大鼠左側(cè)上頜第一磨牙齦溝內(nèi)接種牙齦卟啉單胞菌及牙齦剝離,直到建立模型成功。

1.3.2 結(jié)果判斷 通過(guò)臨床觀察、組織病理及牙齦卟啉單胞菌的檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)均能證明牙周炎模型的建立。

1.4 應(yīng)用血鏈球菌培養(yǎng)活菌體對(duì)大鼠左側(cè)上頜第一磨牙的牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行干預(yù)

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 將經(jīng)檢測(cè)的Wistar大鼠隨機(jī)分為2組,并設(shè)立空白對(duì)照組。

1.4.2 空白對(duì)照組 對(duì)建模時(shí)對(duì)照組中的Wistar大鼠左側(cè)上頜第一磨牙的牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果陰性者中隨機(jī)選取10只。飲食、飲水均正常。不加任何干預(yù)。每4天檢測(cè)一次,共檢測(cè)7次,其觀察牙齦卟啉單胞菌在大鼠口腔中的情況。

1.4.3 活菌體、PBS緩沖液組 對(duì)成功建模后的Wistar大鼠左側(cè)上頜第一磨牙的牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果陰性者中隨機(jī)選取20只共分2組,各組10只,飲食、飲水均正常。從經(jīng)檢測(cè)后開始,兩組每日分別給大鼠左側(cè)上頜第一磨牙牙頸部涂抹活菌體,PBS緩沖液。連續(xù)涂抹28天,每4天檢測(cè)一次,共檢測(cè)7次,其觀察牙齦卟啉單胞菌在大鼠口腔中的情況。

1.4.4 觀察指標(biāo) 臨床觀察:觀察各組大鼠牙齦炎癥情況和X線片牙槽骨吸收及牙周情況。組織病理:各組分別在8周后處死大鼠,分離其上頜骨并截取磨牙段,10%甲醛固定48 h,脫鈣,切片和HE染色,觀察各組大鼠牙周組織病理變化。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察結(jié)果 對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)牙齦紅腫及探針出血情況,X線片示牙槽骨十分致密,未見牙槽骨吸收;牙周炎組牙齦明顯紅腫,探針易出血,X線片顯示可見左側(cè)上頜第一磨牙垂直吸收,明顯可見牙槽骨吸收及根分歧處病變;PBS緩沖液組牙齦紅腫,探針易出血,X線明顯可見牙槽骨吸收及根分歧處病變情況;活菌體組牙齦紅腫及探針出血不明顯,左側(cè)上頜第一磨牙可見遠(yuǎn)中牙槽骨吸收,根分歧處有不同程度的病變。

2.2 組織學(xué)觀察結(jié)果 對(duì)照組大鼠牙周組織結(jié)構(gòu)正常,齦溝上皮、結(jié)合上皮完整無(wú)釘突,牙周膜纖維排列整齊,牙槽骨中未見破骨細(xì)胞;牙周炎組牙齦上皮增生,少量急性炎癥細(xì)胞及大量慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),牙周主纖維束斷裂,牙槽骨明顯吸收,結(jié)合上皮有釘突形成,牙周袋內(nèi)有較多慢性炎癥細(xì)胞;PBS緩沖液組結(jié)合上皮中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),有深牙周袋形成,牙槽骨中可見破骨細(xì)胞,牙槽嵴及臨近牙周膜的牙槽骨吸收較明顯;活菌體組結(jié)合上皮中出現(xiàn)炎性細(xì)胞,牙周袋形成,牙槽嵴頂吸收,可見少量破骨細(xì)胞。

2.3 牙齦卟啉單胞菌的菌落數(shù)變化

2.3.1 建立牙周炎模型成功后對(duì)2組大鼠左側(cè)上頜第一磨牙牙頸部分別涂抹活菌體、PBS緩沖液連續(xù)28天,均4天檢測(cè)一次的整個(gè)觀察期內(nèi)牙齦卟啉單胞菌菌落數(shù)變化情況,見表1。

表1 兩種培養(yǎng)方法不同時(shí)間點(diǎn)菌落數(shù)比較(cfu/ml)(±s)*

表1 兩種培養(yǎng)方法不同時(shí)間點(diǎn)菌落數(shù)比較(cfu/ml)(±s)*

*多變量分析結(jié)果表明四組菌落數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＜0.05

組別時(shí)間(天)未涂菌 4 8 12 16 20 24 28 PBS 133.4±5.5 129.7±5.6 126.4±5.5 122.9±5.0 117.8±3.9 111.7±3.9 105.1±3.8 98.1±3.0活菌 137.9±7.7 132.2±6.5 120.9±6.1 110.5±4.4 98.6±6.2 86.9±4.6 73.6±5.1 55.2±5.9

2.3.2 將活菌體組與PBS培養(yǎng)組菌落數(shù)進(jìn)行比較,可見在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)活菌體組菌落數(shù)均少于PBS培養(yǎng)組的菌落數(shù),隨著時(shí)間的推移可見明顯的差異。證明血鏈球菌的活菌體對(duì)牙齦卟啉單胞菌有拮抗作用。

3 討論

牙周病是一種細(xì)菌感染性疾病,大量的研究表明口腔微生態(tài)系不僅包括一些可疑的致病菌還包括許多牙周有益菌,有益菌與致病菌之間存在相互拮抗的生態(tài)關(guān)系,從而有利于保持或恢復(fù)牙周的健康狀態(tài)。血鏈球菌是口腔生態(tài)系的重要生理菌和牙周有益菌之一,在維持牙周生態(tài)平衡與健康中起重要作用。血鏈球菌對(duì)牙周可疑致病菌的拮抗作用在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型研究中得到初步證明。許多學(xué)者認(rèn)為血鏈球菌能通過(guò)其分泌的過(guò)氧化氫及血鏈素拮抗牙周可疑致病菌[3,4]。此前眾多學(xué)者在進(jìn)行血鏈球菌拮抗作用的體外研究主要應(yīng)用Sabine法[5]進(jìn)行。其結(jié)果表明血鏈球菌對(duì)牙齦卟啉單胞菌、中間普沃菌和具核梭桿菌的生長(zhǎng)均有拮抗作用,其中對(duì)牙齦卟啉單胞菌的作用較強(qiáng)。

對(duì)血鏈球菌的深入研究是牙周病生態(tài)防治工作的重要內(nèi)容,為探討血鏈球菌與牙周可疑致病菌的相互作用及進(jìn)一步明確血鏈球菌拮抗牙周可疑致病菌的機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)將血鏈球菌培養(yǎng)的活菌體對(duì)牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行拮抗,并其觀察了血鏈球菌培養(yǎng)活菌體是否可以阻止或減少牙周可疑致病菌牙齦卟啉單胞菌的生長(zhǎng)。研究結(jié)果表明血鏈球菌培養(yǎng)的活菌體對(duì)牙齦卟啉單胞菌的生長(zhǎng)有拮抗作用,提示血鏈球菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要存在于菌細(xì)胞內(nèi),且活的菌細(xì)胞通過(guò)新陳代謝不斷地產(chǎn)生這類抑菌物質(zhì)作用于周圍環(huán)境中其他細(xì)胞。關(guān)于血鏈球菌培養(yǎng)的活菌體能否在臨床上發(fā)揮作用以及能否將血鏈球菌的活菌體作為一種抗牙周病因子應(yīng)用于牙周病的防治有待進(jìn)一步研究。

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1007-4287(2010)01-0126-02

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(D2007-03)

2009-05-16)