金銀實(shí),胡 毅,王 佳,南光賢*
(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科,吉林長(zhǎng)春 130033;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130062)
疑似肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B基因第8外顯子的基因序列分析1例
金銀實(shí)1,胡 毅1,王 佳2,南光賢1*
(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科,吉林長(zhǎng)春 130033;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130062)
*通訊作者
肝豆?fàn)詈俗冃?hepatolenticular degeneration,HLD)又稱(chēng)wilson病(Wilson‘s disease,WD),是由銅代謝障礙引起的常染色體隱性遺傳性疾病。肝豆?fàn)詈俗冃缘闹虏』驗(yàn)锳TP7B基因,該基因的缺陷將會(huì)影響所編碼的ATP7B活性,使過(guò)量的銅沉積在肝、腦、腎和角膜等組織器官,導(dǎo)致急慢性肝病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎病和角膜色素環(huán)等。我國(guó)學(xué)者研究表明,8號(hào)外顯子的Arg778Leu/Glu突變?yōu)槲覈?guó)ATP7B基因突變的第一熱區(qū),40.9%的肝豆?fàn)詈俗冃曰颊呖梢詸z測(cè)到該突變,染色體突變率為30.7%[1]。血清銅藍(lán)蛋白水平、K-F環(huán)、24小時(shí)尿銅含量、肝銅含量等是診斷WD的常用指標(biāo),簡(jiǎn)單憑借任何一項(xiàng)或幾項(xiàng)指標(biāo)不能確定或排除WD。其臨床癥狀、體征復(fù)雜多樣,往往造成診斷的困難[2-4]。肝豆?fàn)詈俗冃砸彩强梢杂行е委煹倪z傳病之一,其療效及預(yù)后與開(kāi)始治療時(shí)間密切相關(guān)[5]。如果能在發(fā)病早期甚至發(fā)病前確診,通過(guò)藥物治療可以控制病情發(fā)展,提高患者的生活質(zhì)量。反之,如若未能及時(shí)確診,往往會(huì)延誤最佳治療時(shí)間,導(dǎo)致患者肝、腦、腎等組織器官發(fā)生不可逆性損害,致殘甚至死亡。本文通過(guò)對(duì)1例疑似肝豆?fàn)詈俗冃圆±羞z傳基因分析的方法來(lái)確診,并指導(dǎo)治療。
楊XX,男,20歲。因右上肢顫動(dòng)進(jìn)行性加重2年余于2009年2月20日入我院。該患緣于2年前無(wú)明顯誘因出現(xiàn)右上肢震顫,呈進(jìn)行性加重,靜止時(shí)正常,持物或活動(dòng)時(shí)震顫明顯,愈緊張愈明顯,震顫幅度成進(jìn)行性加重,現(xiàn)走路尚可,持物費(fèi)勁。病程中伴有雙下肢色素沉著。為求明確診治遂入我院。病程中偶有飲水返嗆,飲食及睡眠良好,大小便如常,體重減輕。既往健康。否認(rèn)遺傳病家族史,三代以內(nèi)無(wú)類(lèi)似發(fā)病患者。入院時(shí)查體:血壓120/80 mmHg,面色晦暗,肝臟下緣達(dá)到肋弓一下3cm左右,未觸及脾,雙下肢黑色色素沉著,神清語(yǔ)明,示齒時(shí)雙側(cè)面紋對(duì)稱(chēng),伸舌居中,四肢肌張力、肌力正常,四肢腱反射活躍,雙側(cè)有踝陣攣,雙側(cè)Babinski征陽(yáng)性。血清銅藍(lán)蛋白正常。頭部CT未見(jiàn)異常。裂隙燈下角膜未發(fā)現(xiàn)K-F環(huán)。
病例組為疑似肝豆?fàn)詈俗冃曰颊呒捌淠赣H血樣,加入肝素抗凝備用。正常組為無(wú)肝豆?fàn)詈俗冃约不嫉恼H恕?/p>
1.3.1 制備基因組DNA取外周血5 ml,加入肝素抗凝。
1.3.2 全基因組的提取 使用由V-gene公司購(gòu)置的Whole Blood Genomic DNA Mini-prep Kit血液基因組提取試劑盒按說(shuō)明書(shū)要求提取全基因組。提取的DNA樣品用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果。
1.3.3 人ATP7B基因序列第8外顯子序列的獲得從 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索人ATP7B基因序列及其第8外顯子核酸序列。第八外顯子全部序列如下:tcctctgaatgggaaagtatatttcataaacgcccatcacagaggaagaagtactgtcacgactgtgcacaaagctagaggctttgccatccccagggcccttggccctgtgtcgctcattgaactctcctccctacttgctggcagccttcactgtccttgtctttcagctcctcggtgggtggtacttctacgttcaggcctacaaatctctgagacacaggtcagccaacatggacgtgctcatcgtcctggccacaagcattgcttatgtttattctctggtcatcctggtggttgctgtggctgagaaggcggagaggagccctgtgacattcttcgacacgccccccatgctctttgtgttcattgccctgggccggtggctggaacacttggcaaaggtaacagcagcttcaggttcagaaaagagctgctccttcagtaaacaaatctcacttcctctgaacaccatgttta 截取ATP7B全基因序列57 781-58 260 bp,exon8編碼區(qū)為57 951-58 184 bp(黑色斜體標(biāo)出),長(zhǎng)度為234 bp。
1.3.4 設(shè)計(jì)擴(kuò)增第8外顯子片段引物序列 利用Premier 5.0程序設(shè)計(jì)克隆引物序列,上游引物序列為5'-tat ttc ata aac gcc cat cac-3',下游引物序列為5'-gga agt gag att tgt tta ctg aag-3'。根據(jù)設(shè)計(jì)的引物推測(cè),PCR產(chǎn)物理論長(zhǎng)度約為450 bp。
1.3.5 從全基因組中PCR擴(kuò)增ATP7B exon8目的基因 PCR擴(kuò)增全部由Gene Amp PCR System 9600完成,啟動(dòng)子區(qū)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為50 μ L,反應(yīng)液含:基因組DNA2 μ L,4 種 dNTP 混合液 4 μ L,DNA聚合酶 1 μ L,10 ×Ex Taq buffer5 μ L,4ddH2O 34μ L 。PCR擴(kuò)增條件為94℃變性5 min,然后以下列溫度和時(shí)間做35個(gè)循環(huán):94℃30秒、62℃30秒、72℃30秒,最后72℃延伸7分。
1.3.6 PCR產(chǎn)物檢測(cè) PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段大小是否符合要求。
1.3.7 PCR產(chǎn)物原液測(cè)序 將PCR產(chǎn)物原液交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。
1.3.8 測(cè)序結(jié)果比對(duì) 應(yīng)用DNAMAN Version 5.2進(jìn)行核酸及蛋白質(zhì)序列比對(duì)。
2.1 WD血液全基因組的獲得 使用Whole BloodGenomic DNAMini-prep Kit血液基因組提取試劑盒提取人血液全基因組。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)。
圖1 人血液全基因組提取電泳分析
2.2 WD基因exon8基因片段的獲得 以人血基因組為模板,Forward primer和Reverse primer為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增人ATP7B基因exon8片段,PCR產(chǎn)物理論長(zhǎng)度約為450bp可見(jiàn)條帶。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2)。
圖2 人ATP7B基因exon8片段PCR擴(kuò)增電泳分析
2.3 ATP7B基因exon8基因片段測(cè)序結(jié)果 通過(guò)PCR產(chǎn)物測(cè)序檢測(cè)出的突變樣品,經(jīng)核算比對(duì)證實(shí)患者ATP7B基因exon8存在Arg778Leu/G2333T錯(cuò)義突變,同時(shí)伴隨Leu700Leu/C2310G同義突變。
肝豆?fàn)詈俗冃允禽^為常見(jiàn)的常染色體隱性遺傳銅代謝障礙疾病,該病通常發(fā)生于兒童期和青少年期,發(fā)病年齡為5-40歲之間,但20歲以前發(fā)病者較多,男女無(wú)差別,典型病例頭部CT及MRI雙側(cè)豆?fàn)詈藚^(qū)可見(jiàn)對(duì)稱(chēng)性影像改變,血清銅藍(lán)蛋白顯著降低和尿銅排出量增高[6]。本文中疑似病例為青年男性,慢性起病,既往健康,否認(rèn)遺傳病家族史,主要表現(xiàn)為錐體外系癥狀,無(wú)肝臟癥狀,但觸診時(shí)發(fā)現(xiàn)肝大,無(wú)脾大,腹部彩超證實(shí)肝大,未發(fā)現(xiàn)脾大。裂隙燈下查眼部未發(fā)現(xiàn)K-F環(huán)。從發(fā)病形式及臨床表現(xiàn)來(lái)分析高度懷疑肝豆?fàn)詈俗冃?但缺乏診斷依據(jù)。肝豆?fàn)詈俗冃詾闉閿?shù)不多的治療有效的遺傳性疾病,若能獲得早期診斷,恰當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)期系統(tǒng)驅(qū)銅治療,就可使患者享受與健康人一樣的生活和壽命?;蛟\斷被認(rèn)為是早期確診WD的最佳方法。該病的致病基因?yàn)锳TP7B基因,ATP7B已被定位于13q14.3區(qū)。近年來(lái)的研究證實(shí)中國(guó)患者的突變熱區(qū)為ATP7B8號(hào)外顯子的778密碼子[7,8]。筆者通過(guò)對(duì)疑似肝豆?fàn)詈俗冃曰颊呒捌淠赣H、健康人的ATP7B外顯子進(jìn)行基因測(cè)序的方法來(lái)證實(shí)此患者存在8號(hào)外顯子的基因突變,而此突變可能為導(dǎo)致發(fā)病的原因。在本文中,對(duì)病例組及對(duì)照組的ATP7B基因exon8進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示:對(duì)照組的ATP7B基因片段序列與從GenBank檢索到的序列完全一致;疑似肝豆?fàn)詈俗冃曰颊叩牡?外顯子存在純合Arg778Leu/G2333T錯(cuò)義突變,同時(shí)伴隨Leu700Leu/C2310G同義突變;患者母親的ATP7B基因第8外顯子存在雜合的Arg778Leu/G2333T錯(cuò)義突變,并伴隨Leu700Leu/C2310G同義突變。
根據(jù)獲得的ATP7B基因第8外顯子測(cè)序結(jié)果,推測(cè)其基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示,可能存在Arg778Leu突變。而此突變可能為此患者發(fā)病的原因。
Arg778Leu位于ATP7B基因第8外顯子,該區(qū)編碼P型銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶的第四跨膜功能區(qū)(即Tm4),此區(qū)域只要負(fù)責(zé)銅離子的轉(zhuǎn)運(yùn),Arg778Leu突變可能破壞該蛋白的一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu),影響Tm4的形成,使其功能喪失,若其他六個(gè)跨膜功能區(qū)仍具有功能,則其突變后果只能是削弱了銅的轉(zhuǎn)運(yùn)。
綜上筆者對(duì)疑似肝豆?fàn)詈俗冃曰颊遝xon8進(jìn)行檢測(cè)的方法來(lái)指導(dǎo)臨床診斷,進(jìn)行早期干預(yù)?;蛐蛄袡z測(cè)對(duì)于基因快速篩選及早期快速確診具有重大意義。若能夠在發(fā)病早期或?qū)Ω呶H巳哼M(jìn)行診斷,降低患病率及死亡率。若能在產(chǎn)前進(jìn)行診斷,則可以降低患兒的出生率,這對(duì)提高出生人口素質(zhì)有極大推動(dòng)作用。
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1007-4287(2010)01-0110-03
2009-03-08)
中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)2010年1期