呂秋菊,馬晟利,代雪麗

(1.黑龍江省佳木斯大學(xué),黑龍江佳木斯 154002;2.黑龍江省醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150036)

兩種方法建立口腔念珠菌病動物模型的比較

呂秋菊1,馬晟利2*,代雪麗1

(1.黑龍江省佳木斯大學(xué),黑龍江佳木斯 154002;2.黑龍江省醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150036)

*通訊作者

白色念珠菌常見于口腔和陰道。白色念珠菌感染好發(fā)于嬰兒及老人,特別是口內(nèi)有義齒基托的老人。但隨著臨床抗生素、抗癌藥物及免疫抑制劑的應(yīng)用,白色念珠菌病的好發(fā)人群已有擴(kuò)大的趨勢[1]。通過動物模型研究,可以深入了解廣譜抗生素對白色念珠菌的影響。白色念珠菌病的動物模型研究,70年代始獲成功。英國曼徹斯特大學(xué)Rusell[2],Jonse[3],Adams等發(fā)表了研究結(jié)果。80年代初,丹麥阿胡斯皇家牙科學(xué)院Fisker[4],Budtz-Jorgensen[5]等也對此進(jìn)行過研究所使用的方法基本相同,建立模型的成功率為25%。其他國家(瑞典、挪威、美國)亦有零星報道,成功率亦不高。1994年章魁華、王洪君等[6]將建模成功率提高到了100%。但其側(cè)重點(diǎn)為白色念珠菌病與癌癥的關(guān)系。本研究的目的在于建立口腔粘膜白念感染的動物模型并比較青霉素組與普通組在建模方面的差別。亦致力于提高動物模型建立的成功率,為對白色念珠菌感染的認(rèn)識及臨床防治提供基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 白色念珠菌 臨床株98001傳代菌種,由黑龍江省哈爾濱市藥品檢驗(yàn)所提供。

1.2 動物 Wistar大鼠,來自于佳木斯大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)開始時體重200±10 g,6-8周齡。飼料為佳大動物實(shí)驗(yàn)中心提供的標(biāo)準(zhǔn)料塊。分籠飼養(yǎng),每籠4只?；\具及飲水瓶洗凈,滅菌后使用,每周1次。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)前無菌棉拭子涂抹Wistar大鼠口腔粘膜后做白色念珠菌培養(yǎng),每周2次,共2周。白色念珠菌培養(yǎng)陽性的大鼠淘汰,共淘汰2只。陰性的大鼠隨機(jī)分為以下3組:

1.3.1 對照組 18只,不加任何干預(yù),每天在乙醚麻醉下,用無菌小油畫筆蘸無菌PBS液涂抹大鼠右頰側(cè)口腔粘膜2次。

1.3.2 青霉素組 40只,實(shí)驗(yàn)開始時在大鼠的飲水中加入阿莫西林使其濃度為1%,2周后濃度改為0.1%直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。同時每天在乙醚麻醉下,用無菌小油畫筆蘸濃度為6×106cfu/ml的白色念珠菌液涂抹大鼠右頰側(cè)口腔粘膜2次。每周用無菌探針輕劃大鼠右頰側(cè)口腔黏膜3下,以不劃破黏膜為準(zhǔn)。

1.3.3 普通組 40只,實(shí)驗(yàn)開始時大鼠的飲食不加干預(yù),每天在乙醚麻醉下,用無菌小油畫筆蘸濃度為6×106cfu/ml的白色念珠菌液涂抹大鼠右頰側(cè)口腔粘膜2次。每周用無菌探針輕劃大鼠右頰側(cè)口腔黏膜3下,以不劃破黏膜為準(zhǔn)。

1.4 細(xì)菌檢測 每4周全部動物停止涂白色念珠菌液1周,用15#無菌紙尖在大鼠右頰側(cè)患病處反復(fù)涂抹10秒鐘,取標(biāo)本溶于20 μ l稀釋液中,振蕩 1 min使其充分溶解混勻。再依次進(jìn)行10倍系列稀釋至 10-6,從原液開始選擇 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋度,滴種在沙保羅培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)48小時后,記數(shù)菌落。

1.5 病理學(xué)檢測 隨機(jī)選擇以上3組中建模成功的大鼠各1只,處死并取涂菌處粘膜固定、脫水、包埋和切片。常規(guī)HE染色和PAS染色光鏡下觀查以進(jìn)一步確定建模成功。結(jié)果陽性者停止涂白色念珠菌液其它條件不變單獨(dú)飼養(yǎng),間隔1周再做白色念珠菌培養(yǎng)如結(jié)果陽性則認(rèn)定建模成功,結(jié)果陰性者繼續(xù)涂菌直至建模成功。

2 結(jié)果

2.1 全部對照組動物在試驗(yàn)過程中檢菌皆為陰性,組織學(xué)檢查亦皆為陰性。

2.2 實(shí)驗(yàn)組動物檢查結(jié)果

2.2.1 臨床觀察可見涂菌側(cè)頰粘膜表面白色絨狀斑片,用力擦掉后可見紅色充血糜爛面。與對照組有明顯差異。

2.2.2 將于患處取分泌物涂片,經(jīng)革蘭氏染色,鏡下見酵母樣孢子。

2.2.3 將于患處取分泌物標(biāo)本接種于沙保羅培養(yǎng)基上可見乳白色菌落,似奶酪樣。

2.2.4 將于患處取分泌物標(biāo)本接種于念珠菌顯色培養(yǎng)基上可見淡綠色菌落,似奶酪樣。

2.2.5 組織學(xué)檢查 本實(shí)驗(yàn)的80只大鼠在結(jié)束實(shí)驗(yàn)時,處死以上四種檢驗(yàn)均陽性的大鼠取其患處粘膜做病理學(xué)檢測,PAS染色可見上皮棘層增生,上皮釘突呈圓形,基底膜部分被炎癥破壞。在粘膜上皮外1/3有菌絲侵入。結(jié)果顯示青霉素組和普通培養(yǎng)組白念病在組織學(xué)上無明顯差異。

2.2.6 實(shí)驗(yàn)情況 見表1。多變量分析結(jié)果表明將各個時間點(diǎn)整體來看青霉素組11周的菌落數(shù)與普通組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。由表1我們可以看出青霉素組菌落數(shù)在各個時間點(diǎn)菌落數(shù)均高于普通組,且隨著時間的推移,差別越來越大。青霉素組的菌落數(shù)增長迅速,普通組菌落數(shù)相對緩慢。

表1 青霉素組與普通組11周的菌落數(shù)比較(±s)(cfu/ml)

表1 青霉素組與普通組11周的菌落數(shù)比較(±s)(cfu/ml)

*多變量分析結(jié)果表明青霉素組與普通組比較11周的菌落數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異,P＜0.05

組別 例數(shù)時間(周)1 3 5 7 9 11青霉素組* 40 0.17±0.08 0.96±0.15 2.46±0.15 4.26±0.31 5.84±0.23 6.54±0.43普通組 40 0.08±0.01 0.14±0.05 0.62±0.13 0.84±0.18 1.20±0.12 1.98±0.15

3 討論

本研究的建模成功率為100%,且建模時間比相關(guān)文獻(xiàn)要短。其原因可能為:一是青霉素組大鼠飲水中加入廣譜抗生素,給予青霉素水時,采用了不間斷給藥,與其他研究不同(一般第1周給0.1%,第2、3周給0.01%,然后停止),這也可能是提高成功率的原因。二是青霉素組與普通培養(yǎng)組大鼠均每周用探針輕劃粘膜表面,且不劃破為準(zhǔn)。既給粘膜表面造成了創(chuàng)傷,又不會因?yàn)閯?chuàng)傷過大而造成粘膜深部感染。

在上述結(jié)論中青霉素組感染白色念珠菌比普通組明顯,這也說明長期應(yīng)用抗生素往往使得患者體內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境從一種失調(diào)轉(zhuǎn)變成了另一種失調(diào)?？谇晃⑸鷳B(tài)平衡是指口腔生態(tài)系在一定時間內(nèi)結(jié)構(gòu)與功能的相對穩(wěn)定狀態(tài),是口腔微生物和宿主生理功能的高度統(tǒng)一的平衡狀態(tài)。當(dāng)然,這種平衡是動態(tài)的平衡。健康口腔是口腔生態(tài)平衡的重要表現(xiàn)形式。在健康口腔中其結(jié)構(gòu)和功能以及微生物的組成、分布均處于相對的穩(wěn)定狀態(tài),并沿著正常的生理性演替次序進(jìn)行著動態(tài)變化。然而,當(dāng)在外界因素作用下,菌群的波動超過了微群落內(nèi)部所能承受的能力后,口腔微生態(tài)失調(diào)隨之發(fā)生,某些條件致病菌迅速生長、繁殖,有益菌明顯減少,導(dǎo)致感染性疾病的發(fā)生?？股?、免疫抑制劑等的長期、大量的使用可引起定植抗力明顯減低,外源性特定致病菌入侵機(jī)會增大,導(dǎo)致特定感染性的疾病的發(fā)生。目前廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用,念珠菌的發(fā)病率顯著增加。發(fā)病率的上升有兩種原因:一是無針對性地應(yīng)用“廣譜”導(dǎo)致菌群失調(diào);二是近些年人們對念珠菌病逐漸認(rèn)識,診斷率提高的緣故?？股貙?dǎo)致珠菌感染已被公認(rèn),人們對失調(diào)的機(jī)理一直在探討,可能有以下幾個原因:菌群失調(diào)、菌體成份、增強(qiáng)菌體毒性、自身毒性作用、降低免疫力。這就要求我們醫(yī)務(wù)工作者慎用抗生素。

隨著微生態(tài)學(xué)理論的發(fā)展和微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用,生物拮抗作用逐漸被人們認(rèn)識。未來的感染性疾病的治療理念不再是殺滅所有的微生物,而是以通過扶持體內(nèi)的有益菌來拮抗可疑的致病菌,以達(dá)到一種動態(tài)的,健康的微生態(tài)平衡。

[1]Almirante B,Rodriguez D,Park BJ.Epidemiology and Predictors of Mortality in Cases of Candida Bloodstream Infection:Results from Population-Based Sarcdlona,Spain,from 2002 to 2003[J].J Clin Microbiol,2005,43(4):1829.

[2]Rusell C,Jonse JH.Effects of oral inoculation of candida albicans in tetracycline-treated rats[J].MedMicrobiol,1973,6:275.

[3]Jones JH.Adams D.Expeimentally induced acute oral candidosis in the rat.Brit J Derm,1970,83:670.

[4]Fisker AV.Long ter m oral candidosis in rats.Acta path microbial immunol scand Section B,1982,92:221.

[5]Budtz-Jorgensen E.Denture stomatitis.Anexperimental model inmonkeys.Acta Odontol Scand,1971,9:513.

[6]章魁華,王洪君,傅 嘉,等.口腔粘膜白色念珠菌感染的動物模型研究[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,1994,29(5):266.

1007-4287(2010)02-0289-02

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目項(xiàng)目編號:D2007-03

2009-05-28)