劉合義,余麗蕓,侯喜林,孫留霞,周玉龍,王進軼,劉雙翼,樸范澤

牛冠狀病毒N基因的原核表達及初步應用*

劉合義,余麗蕓,侯喜林,孫留霞,周玉龍,王進軼,劉雙翼,樸范澤

目的獲得牛冠狀病毒N基因的全長序列,實現(xiàn)N基因在大腸桿菌中的高效表達,并進行初步應用。方法根據(jù)已發(fā)表的牛冠狀病毒M ebus株的序列設(shè)計引物,對BCV-DQ株進行RT-PCR擴增、克隆和測序;將該基因插入到原核表達載體pET-30a(+)上進行原核表達,SDS-PAGE和Western blot檢測;用純化的重組N蛋白作為包被抗原,建立ELISA檢測方法,對部分臨床樣本進行檢測。結(jié)果BCV-DQ株N基因全長1 347bp,與GenBank已發(fā)表的6株BCV的N基因相比較,核苷酸同源性98.3%以上。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-N能表達出一條大小約為60 ku的蛋白,且能與鼠抗BCV血清發(fā)生特異性反應。用建立的ELISA方法對黑龍江不同地區(qū)送檢的共256份牛血清樣品進行檢測,結(jié)果陽性率65.23%,與病毒中和試驗的符合率達95.31%。結(jié)論BCV N基因保守性很高,并在原核表達系統(tǒng)中獲得了高效表達,其表達產(chǎn)物具有良好的免疫反應原性。臨床檢測結(jié)果表明N蛋白可作為診斷抗原用于牛冠狀病毒病的流行病學調(diào)查。

牛冠狀病毒;N基因;克隆;序列分析;原核表達

牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus,BCV)是冠狀病毒科冠狀病毒屬成員,為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒,是引起犢牛腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道疾病的主要病原〔1〕。冠狀病毒屬成員分為4個抗原群:第1群包括人冠狀病毒HCV-229E、豬傳染性胃腸炎病毒、犬冠狀病毒等;第2群包括BCV、豬血凝性腦脊髓炎病毒、小鼠肝炎病毒、人冠狀病毒HCoV-OC43等;第3群成員有傳染性支氣管炎病毒等;第 4群為SARS冠狀病毒〔2-3〕。BCV基因組大小約32 kb,編碼5種主要結(jié)構(gòu)蛋白,即纖突蛋白(S)、核蛋白(N)、膜蛋白(M)、小膜蛋白(E)和血凝素酯酶蛋白(HE)〔4〕。其中核衣殼蛋白基因(N)是BCV主要結(jié)構(gòu)蛋白基因,與基因組RNA組裝成核糖核蛋白復合物〔5〕。N蛋白不僅在病毒致病性、轉(zhuǎn)錄和翻譯及增強細胞免疫等方面也起到重要作用,而且具有輔助增強病毒 RNA復制的能力〔6-7〕。N基因高度保守,可作為診斷BCV的候選基因〔8〕。

本研究欲對BCV-DQ株N基因進行克隆和序列分析,同時對N基因進行原核表達和純化,獲得具有特異性的診斷抗原,建立ELISA方法并對臨床標本進行初步檢測。

1 材料和方法

1.1 病毒、細胞、菌株和質(zhì)粒 BCV-DQ株、表達載體pET-30a(+)、宿主菌 DH5α、BL21(DE3)由本實驗室保存。HRT-18(人直腸癌細胞)購自中科院上海細胞庫。

1.2 試劑 pMD18-T載體、TaqDNA聚合酶、dNTP、RNA 酶抑制劑、M-MLV、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ等購自Fermentas公司;Trizol Reagent購自 Invitrogen 公司 ;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均為大連寶生物工程有限公產(chǎn)品;羊抗鼠IgG-HRP購自Sigma公司;DAB購自AMRESCO公司;其他試劑均為分析純試劑。

1.3 試驗動物 BALB/c小鼠由長春實驗動物中心提供。

1.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的BCV U00735 Mebus株 N基因全序列,利用DNAStar和Prime 5.0設(shè)計1對引物,在上游引物中引入BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點,在下游引物中引入XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點(酶切位點用斜體加粗標記),預計擴增片斷為1 347 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。序列如下:

1.5 病毒RNA的提取 用 Trizol試劑提取病毒總 RNA 。取細胞病毒液約 200 μ L,加入 600 μ L Trizol,振蕩 30 s,靜置 2～ 3 min;加入氯仿 200 μ L,靜置待其分層,然后12 000 r/min離心15 min;這時液體分成3層,最上層為 RNA層,中間為蛋白層,最下層為DNA層,小心吸取 RNA層,移入另一離心管中;500 μ L異丙醇加入含有RNA的離心管中混勻,靜置10 min,12 000 r/min離心 10 min,小心吸棄液體;向沉淀加入75%乙醇1 mL,混懸沉淀,然后7 500 r/min離心5 min;吸棄乙醇,放入真空干燥機5 min,使管內(nèi)殘留的乙醇揮發(fā),但要避免過分干燥 RNA;加入20 μ L無 RNA酶的去離子水溶解核酸,-70℃保存或直接做反轉(zhuǎn)錄。

1.6 目的基因的擴增、克隆及序列分析

1.6.1 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 吸取5 μ L提取的RNA樣品溶液放于離心管中,加入3 μ L下游引物,3 μ L 無 Rnase 水,70℃預熱5 min,冰浴5 min,依次加入 4μ L 5 ×反轉(zhuǎn) 錄緩 沖液 、3 μ L 10mmol/L dNTPs 、1μ L Rnasin(40U/μ L)、1μ L M-MLV,總體積 20 μ L,42℃溫浴 1h 。

1.6.2 PCR擴增反應體系(25 μ L) 10×PCR Buffer緩沖液 2.5 μ L,dNTP 2 μ L,上下游引物各 1 μ L,Taq DNA 聚合酶 0.5μ L,模板 2 μ L,加水至 25 μ L。同時設(shè)陰性對照。循環(huán)參數(shù)為:94℃5min,94℃1 min,58℃1min30s,72℃2 min,共35個循環(huán),最后72℃延伸10 min。

1.6.3 N基因克隆及序列分析 將PCR產(chǎn)物純化回收,并與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,用含Amp+的 LB瓊脂平板篩選,提取質(zhì)粒,酶切鑒定重組質(zhì)粒,陽性克隆命名為pMD-N,送上海生工測序。對測序結(jié)果用DNAstar軟件進行序列分析。

1.7 重組原核表達載體的構(gòu)建 用BamHⅠ和XhoⅠ從pMD-N質(zhì)粒上雙酶切下目的基因片斷,純化回收后與同樣雙酶切的pET-30a(+)載體相連,轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細胞,用含卡那霉素的LB瓊脂平板篩選,挑取單個白色菌落于37℃過夜培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pET-N。

1.8 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達及SDS-PAGE凝膠電泳〔9〕將 pET-N陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 BL21(DE3)中,挑取單個菌落接種含卡那霉素(30 mg/L)的LB培養(yǎng)基中,于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6～1.0時,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導表達目的蛋白,并分別在3 h、4 h和5 h時取1.0 ml菌液,同時收集未誘導的菌液作為陰性對照,對經(jīng)轉(zhuǎn)化BL21的空載體也以相同的條件誘導,作為對照。于12%SDS-PAGE分離膠上進行電泳分析。

1.9 表達蛋白的回收與純化 參照分子克隆實驗指南〔10〕,利用電洗脫的方法純化蛋白。

1.10 制備鼠抗BCV陽性血清 取經(jīng)過蔗糖密度離心純化的BCV病毒液1 mL與等量弗氏完全佐劑混合,制成乳化劑。第1次免疫給BALB/c健康小鼠腹腔注射乳化劑(0.3mL/只),然后每隔2周用不完全弗氏佐劑加強免疫1次,免疫劑量、途徑與第一次相同。第3次免疫后7 d采血、分離血清,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.11 重組蛋白的Western blot鑒定 將純化后的融合蛋白進行 Western blot檢測鑒定。將 SDSPAGE蛋白帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,用含5%脫脂奶粉的PBST封閉,以鼠抗BCV血清為一抗,羊抗鼠IgG-HRP為二抗,DAB染色。

1.12 臨床初步應用 用純化的N蛋白作為包被抗原,通過方陣試驗確定了抗原的最適包被濃度為1.75 μ g/mL,血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶200,酶標二抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶8 000,初步建立了檢測牛冠狀病毒抗體的間接ELISA方法。對黑龍江省內(nèi)不同地區(qū)共256份牛血清樣品進行檢測,并與中和試驗進行比較,計算其符合率。

2 結(jié) 果

2.1 N基因的擴增和克隆 RT-PCR擴增出約1 347bp左右大小的片段,與預測結(jié)果一致(圖1)?；厥諗U增產(chǎn)物,克隆到pMD18-T載體中,得到重組質(zhì)粒pMD-N,經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定正確(圖2)。2.2 序列測定與分析 我們將N序列提交Gen-Bank,獲得 Accession:FJ556872。用 DNAStar軟件分析測序結(jié)果,與GenBank上BCV各株之間的同源性比較得出,BCV-DQ株與USA(AF058942株)的同源性在100%,與BCoV-ENT(AF391541)的同源性在98.3%,與參考株Mebus U00735的同源性在99.3%,與Germany(EF193073)株的同源性在 99.2%。與呼吸道分離株 BCoV-LUN(AF391542)株的同源性在98.4%。

將其它冠狀病毒N基因序列從GenBank下載后用DNAStar軟件進行多重比對,構(gòu)建出了進化關(guān)系樹,由圖3可見BCV與人冠狀病毒OC43及人腸道冠狀病毒4408親緣關(guān)系最為接近。

圖3 冠狀病毒N基因進化關(guān)系樹Fig.3 Phylogenetic tree of N genes fromdifferent coronavirus.

通過DNAStar Protein程序?qū)ν茖У腘基因氨基酸序列的親水性、抗原性和表面可能性預測,發(fā)現(xiàn)100～111、269～280、390～410和415～429區(qū)段顯示出很高的親水性、抗原指數(shù)和表面可能性

(如圖4)。

圖4 N蛋白的親水性、抗原指數(shù)及表面可能性分析Fig.4 Hydrophilicity plot,antigenic index and surface probability plot for N protein.

2.3 重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定 將所獲得的重組表達質(zhì)粒pET-N用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定,酶切結(jié)果與預期大小相符(圖5)。

2.4 SDS-PAGE電泳及目的蛋白的回收、純化結(jié)果 N基因表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳后,經(jīng)染色、脫色,發(fā)現(xiàn)含重組質(zhì)粒的誘導菌在60 ku處出現(xiàn)一條特別粗的蛋白帶,大小與融合蛋白的理論值一致,隨著誘導時間的增加,其表達量隨之增加,在5 h時達到最大值,而未誘導的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌沒有出現(xiàn)相同的條帶(圖6)。用電洗脫方法回收、純化的蛋白,純度較高,結(jié)果見圖7。

2.5 重組蛋白的免疫活性鑒定 經(jīng)Western blot鑒定(如圖8),純化的表達產(chǎn)物與鼠抗BCV血清發(fā)生反應,而未經(jīng)重組的菌體不發(fā)生反應。

圖8 重組蛋白的Western blot鑒定Fig.8 Western blot analysis of the expressed product

2.6 臨床初步應用 對黑龍江不同地區(qū)送檢的共256份牛血清樣品的檢測結(jié)果(表1)顯示陽性樣品167份,陽性率65.23%,與病毒中和試驗方法的檢測結(jié)果符合率達95.31%。

表1 重組N蛋白-ELISA的檢測應用Table 1 Application of recombinant N protein based ELISA

3 討 論

本試驗采用RT-PCR技術(shù)擴增了BCV-DQ株的N基因全長序列并克隆入pMD18-T載體中,通過鑒定后再亞克隆入pET-30a(+)表達載體中構(gòu)建了重組表達載體。核苷酸序列測定顯示擴增片段長度為1 347 bp,包括完整的N基因開放閱讀框,N基因全長為1 347 bp,編碼448個氨基酸。核苷酸序列與GenBank所發(fā)表的其它BCV序列的同源性可達98.3%以上,氨基酸同源性在98.7%以上,證明N基因的序列非常保守,與 Lapps等〔8〕、Arnold等〔11〕的報道一致。選擇表達的 N蛋白建立的ELISA方法可用于BCV臨床診斷及血清流行病學調(diào)查。

將其它冠狀病毒N基因序列從GenBank下載后進行同源性比較,利用DNAStar軟件繪制的冠狀病毒進化關(guān)系樹與 2001年國際病毒分類委員會(ICTV)公布的關(guān)于BCV的分類群相符合。BCV與人的冠狀病毒OC43的同源性最高,表明了BCV存在感染人的可能性。國內(nèi)外不少研究者從人血清中檢測到了BCV抗體,進一步證實了BCV可能感染人〔12-13〕。在臨床樣品檢測中也發(fā)現(xiàn)了這一特點,如鼠和大鼠、雞和火雞、人和冠狀病毒存在宿主轉(zhuǎn)移現(xiàn)象〔14〕。

用DNAStar Protean程序推測、分析N蛋白的親水性、抗原性和表面可能性,在 100～111、269～280、390～410和 415～429區(qū)段的親水性指數(shù)、抗原指數(shù)較高,其呈現(xiàn)在蛋白表面的可能性也比較大,推測這幾段區(qū)域可能是N蛋白的主要抗原位點。

本試驗將成功擴增的BCV N基因插入到原核表達載體pET-30a上,在E.coliBL21(DE3)工程菌株內(nèi)成功進行了表達。Western blot分析結(jié)果證明該蛋白具有良好的反應原性。原核表達載體pET-30a可高效穩(wěn)定表達外源蛋白,并具有表達量高、純化工序簡單、成本低廉的優(yōu)點,便為臨床樣本檢測制備相應的抗原。用純化的重組N蛋白對256份送檢血清的檢測,結(jié)果進一步證明,N蛋白可以作為診斷抗原用于牛冠狀病毒病的流行病學調(diào)查。

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Prokaryotic expression of the nucleocapsid protein gene in bovine coronavirus and its preliminary application

LIU He-yi,YU Li-yun,HOU Xi-lin,SUN Liu-xia,ZHOU Yu-long,WANG Jin-yi,LIU Shuang-yi,PIAO Fan-ze

(Animal Technology College of Heilongjiang August First Land Reclamation University,Daqing163319,China)

To obtain and analyze the sequence of the nucleocapsid gene from bovine coronavirus,and to produce the fusion protein of the N gene inE.coliin order to use this recombinant protein for the study of bovine coronavirus.The N gene of BCV-DQ strain was amplified by RT-PCR,in which the primers were designed on the basis of N gene sequence of BCV-Mebus strain.The PCR products of 1 347 bp in length were cloned and sequenced,and then inserted into the prokaryotic vector pET30a.The recombinant plasmids were then transformed intoEscherichia coliBL21 and identified by SDS-PAGE and Western blot assay.ELISA assay was optimized of N protein as the coating antigen to detect the viruses in the clinical samples.In comparison with 6 BCV strains in GenBank,the sequence identity was proved to be more than 98.3%.Result in SDS-PAGE showed that the fusion protein had a molecular weight of 60 ku,and could be specifically recognized by mouse serum against BCV.The indirect ELISA was used to test 256 serum samples collected from Heilongjiang province and 65.23%samples were positive.On testing field samples,an overall agreement of 95.31%was generated between the the neutralization test of viruses(VN)and indirect ELISA.It is apparent that the N gene was highly conservative and is expressed inE.coliin high level,also the prokaryotic expression products of this gene show a fine reactiongenicity in immune responses.It was also suggested that the N protein may be a useful antigen for sero-diagnosis and epidemiological investigation of BCV.

bovine coronavirus;N gene;cloning;sequence analysis;prokaryotic expression

S852.65

A

1002-2694(2010)01-0076-05

*黑龍江農(nóng)墾總局攻關(guān)課題(HNKXIV-08-07)

侯喜林,Email:xly_hou@yahoo.com.cn

黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院,大慶 163319

2009-02-18;

2009-09-09