徐愛秋 王夢芝 王洪榮* 李世霞

(1.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，揚州 225009;2.上海禾豐飼料有限公司，上海 201807)

隨著人們對反芻動物蛋白質(zhì)營養(yǎng)以及瘤胃微生物研究的深入，人們逐漸認識到不同的氨基酸或不同類別的氨基酸亞組如芳香氨基酸亞組、支鏈氨基酸亞組等可以刺激瘤胃微生物的生長并可能產(chǎn)生不同的效果[1-2]。Kajikawa等[3]報道當亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸中的任意1種從20種蛋白質(zhì)氨基酸中去除時，這些混合氨基酸對瘤胃微生物生長的促進效應就會降低。有關(guān)氨基酸對瘤胃微生物的影響以及對微生物生長的限制性報道相對較少，且瘤胃微生物純培養(yǎng)的條件要求嚴格，篩選工作也比較困難和費時[4]。因此，大量研究都是基于混合微生物的。本研究借助體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)混合瘤胃微生物，利用分子生物學技術(shù)，以3種瘤胃蛋白質(zhì)降解菌為研究對象，旨在研究體外培養(yǎng)條件下氨基酸對嗜淀粉瘤胃桿菌(R.amylophilus)、溶纖維丁酸弧菌(B.fibrisolvens)和棲瘤胃普雷沃氏菌(P.ruminicola)生長限制性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理

選用4頭身體健康、1.2歲、體重(22.5±1.4)kg裝有永久性瘤胃瘺管的徐淮山羊，用于采集瘤胃液。每日按體重的2%干物質(zhì)量給料，精料組成及營養(yǎng)水平見表1，精(玉米-豆粕)粗(青干草)比為3∶7，每日08:00和20:00等量飼喂，自由飲水。

1.2 體外發(fā)酵裝置

體外發(fā)酵裝置由恒溫振蕩水浴鍋和250 mL帶三孔(進氣口、出氣口及采樣通道)橡皮塞的三角燒瓶組成。三角燒瓶用三孔橡皮塞塞好后，調(diào)節(jié)CO2氣體流量，使其在39℃溫度條件下培養(yǎng)。

1.3 人工唾液鹽

按照Menke等[5]的方法配制:準確量取782.4 mL A 液(K2HPO4382.51 mg、KH2PO4292 mg、(NH4)2SO4480 mg、NaCl 200 mg、MgSO4?7H2O 100 mg和 Na2CO34 000 mg，定容至 1 000 mL)、8 mL B液(EDTA 500 mg、FeSO4?7H2O 200 mg、ZnSO4?7H2O 10 mg、H3BO330 mg、CoCl2?2H2O 1 mg、CuCl2?2H2O 1 mg、NiCl2? 2H2O 2 mg和NaMoO43 mg，定容至1 000 mL)、8 mL D 液(硫胺素20 mg、泛酸鈣 20 mg、煙酰胺 20 mg、吡哆醇20 mg、對羥基苯甲酸 1 mg、生物素 0.2 mg、葉酸0.125 mg和四氫葉酸 0.125 mg，定容至1 000 mL)，充分混和，培養(yǎng)前 1 h加入 1.6 mL C液(Na2S?9H2O 25 g，定容至 100 mL)，充分混合后持續(xù)通入CO2氣體約15 min，39℃水浴待用。

表1 精料組成與營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of concentrate (DM basis)

1.4 試驗設(shè)計

試驗設(shè)定全量氨基酸(在王夢芝等[6]研究10種必需氨基酸基礎(chǔ)上增加7種非必需氨基酸，共含有17種氨基酸，配比參考Clark等[7]，稍做調(diào)整)，全量氨基酸氨基酸組成見表2。采用特定氨基酸去除法，依次分別從全量氨基酸(A組)去除蛋氨酸(B組)、賴氨酸(C組)、支鏈氨基酸(異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸)(D組)和芳香族氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸)(E組)。各組中去除的氨基酸均以谷氨酸鈉等量代替。各組添加相同的碳源物質(zhì)(纖維二糖、木糖和葡萄糖，質(zhì)量比為 25∶25∶50)，碳源物質(zhì)和氨基氮以質(zhì)量比4.5∶1的比例添加作為能源。每個底物設(shè)2個重復。

表2 全量氨基酸氨基酸組成(分析純)Table 2 Amino acid composition of the total amino acid(AR，%)

1.5 試驗方法

1.5.1 瘤胃液的采集

利用自制真空負壓裝置，通過瘤胃瘺管從4頭山羊瘤胃內(nèi)采取瘤胃液各250 mL(晨飼前)，過4層紗布，濾液裝于事先通有CO2氣體的滅菌生理鹽水瓶中，混合均勻，39℃水浴保溫。

1.5.2 體外培養(yǎng)和樣品采集

將采集的瘤胃液與人工唾液鹽按照1∶2的比例混勻，厭氧條件下，39℃水浴保溫培養(yǎng)16 h后用于提取微生物DNA。

1.5.3 3種蛋白質(zhì)降解菌的定量

DNA的提取[8]:取培養(yǎng)后瘤胃液5 mL置于滅菌的5 mL離心管中，22 000×g離心 10 min，棄上清液，沉淀加入2 mL 2%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，充分混勻，置-20℃冰箱至完全凍結(jié);取出在60℃水浴恒溫振蕩器中水浴振蕩60 min;加入0.25 mL蛋白酶K(2 mg/mL)和0.25 mL 20%的十二烷基硫酸鈉(SDS)，反復凍融3次，冷卻至室溫;加入與樣品等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液(體積比為25∶24∶1)，輕柔混勻30 min;22 000×g離心10 min，取上清液，加入適量的氯仿∶異戊醇混合液(體積比為24∶1)，水浴震蕩 30 min;重復上一步;22 000×g離心10 min，取上清液加適量異戊醇，-20℃過夜沉淀DNA;22 000×g離心10 min，沉淀用適量70%乙醇洗滌2次，離心棄乙醇;自然晾干，加入300 μ L TE溶解DNA，放入-20 ℃冰箱內(nèi)保存。采用 ND-1000 spectrophotometer測定DNA濃度后，將所有樣品用 TE稀釋到相同的濃度。

保守區(qū)域片段的擴增:以瘤胃混合微生物總DNA為模板，分別設(shè)計嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌的擴增引物(表3)，PCR擴增體系見表4。PCR擴增反應條件為嗜淀粉瘤胃桿菌:94℃預變性4 min，94℃變性30 s，49.8 ℃退火50s，72℃延伸50 s，30個循環(huán)后72℃再延伸 10 min;溶纖維丁酸弧菌:94℃預變性4 min，94 ℃變性 30 s，50.9 ℃退火 50 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)后72℃再延伸10 min;棲瘤胃普雷沃氏菌:94℃預變性4 min，94℃變性30 s，61.4℃退火50 s，72℃延伸50 s，30個循環(huán)后72℃再延伸10 min。取擴增產(chǎn)物 10 μ L，1.0%瓊脂糖凝膠電泳、拍照。電泳條帶用 Bandscan 5.0軟件進行分析。

表3 擴增引物序列的設(shè)計Table 3 The design of amplification primer sequences

表4 PCR擴增反應體系Table 4 PCR amplification reaction system (μ L)

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行整理，運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件中的One-way ANOVA進行方差分析和LSD多重比較，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃蛋白質(zhì)降解菌PCR擴增結(jié)果

由圖1、圖2和圖3可見，擴增所得的PCR產(chǎn)物片段長度為200 bp左右，與預計序列片段大小相一致。

圖1 嗜淀粉瘤胃桿菌的PCR產(chǎn)物Fig.1 Products of R.amylophilus PCR amplification

2.2 氨基酸對體外培養(yǎng)瘤胃蛋白質(zhì)降解菌生長限制性的影響

由表5可以得知，缺省特定氨基酸的底物條件對嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌的生長有一定的限制作用。對嗜淀粉瘤胃桿菌的影響:E組顯著低于其他4組(P＜0.05)，而A組、B組、C組和D組之間差異不顯著(P＞0.05);對溶纖維丁酸弧菌的影響:C組顯著低于其他4組(P＜0.05)，而A組、B組、D組和E組之間差異不顯著(P＞0.05);對棲瘤胃普雷沃氏菌的影響:A組顯著高于其他4組(P＜0.05)，而B組和C組顯著高于D組和E組(P＜0.05)，B組和C組之間及D組和E組之間差異不顯著(P＞0.05)。由表5可知，特定氨基酸缺省對嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌的生長限制性不同。特定氨基酸的缺省對瘤胃蛋白質(zhì)降解菌嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌的生長限制性作用(相對于全量氨基酸組)排序分別為:芳香族氨基酸＞賴氨酸＞支鏈氨基酸＞蛋氨酸;賴氨酸＞芳香族氨基酸＞支鏈氨基酸＞蛋氨酸;支鏈氨基酸＞芳香族氨基酸＞蛋氨酸＞賴氨酸。

表5 瘤胃蛋白質(zhì)降解菌的定量分析(灰度值的對數(shù))Table 5 Quantitative analysis of ruminal protein-degrading bacteria(logarithmic of gray value)

3 討 論

研究表明氨基酸缺乏會限制瘤胃微生物的生長。Chen等[9]去除瘤胃微生物培養(yǎng)液中亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸后微生物密度降低了65%，去除絲氨酸后微生物密度降低了35%，而去除其他16種氨基酸后微生物密度幾乎不受影響，推測亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和絲氨酸可能是某些微生物生長的限制性氨基酸。Kajikawa等[3]報道當亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸中的任意1種從20種蛋白質(zhì)氨基酸中去除時，這些混合氨基酸對瘤胃微生物生長的促進效應就會降低。Atasoglu等[10]的研究也表明一些氨基酸如蛋氨酸、賴氨酸等可能限制微生物的生長。王夢芝等[6]利用特定氨基酸缺省底物培養(yǎng)瘤胃混合微生物發(fā)現(xiàn)，支鏈氨基酸對瘤胃微生物的生長限制性最大。也有研究表明芳香族氨基酸對微生物的生長限制性較大[11-12]。某些微生物的生長同樣需要特定的氨基酸或者氨基酸亞組，有研究表明產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌需要苯丙氨酸，棲瘤胃普雷沃氏菌需要蛋氨酸[13]。本研究結(jié)果表明3種瘤胃蛋白質(zhì)降解菌的生長需要支鏈氨基酸、芳香族氨基酸、蛋氨酸和賴氨酸，但這幾種氨基酸對嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌生長的限制性有所不同:芳香族氨基酸可能是嗜淀粉瘤胃桿菌生長最需要的;賴氨酸可能是溶纖維丁酸弧菌生長最需要的;支鏈氨基酸可能是棲瘤胃普雷沃氏菌生長最需要的。

4 結(jié) 論

特定氨基酸缺省對嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌的生長限制性作用分別為芳香族氨基酸＞賴氨酸＞支鏈氨基酸＞蛋氨酸;賴氨酸＞芳香族氨基酸＞支鏈氨基酸＞蛋氨酸;支鏈氨基酸＞芳香族氨基酸＞蛋氨酸＞賴氨酸。

[1] Sen-Ghedalia，McMeniman D N P，Rmstrong D G A.The effect of partially replacing urea nitrogen with protein N on N capture in the rumen of sheep fed a purified diet[J].British Journal of Nutrition，1978，39:37-42.

[2] Kajikawa H，Mitsumori M，Tajima K，et al.Short communication:amino acids antagonistic to the amino acids inhibitory for growth rate of mixed ruminal bacteria[J].Journal of Dairy Science，2005，88:2 601-2 603.

[3] Kajikawa H，Mitsumori M，Ohmomo S.Stimulatory and inhibitory effects of protein amino acids on growth rate and efficiency of mixed ruminal bacteria[J].Journal of Dairy Science，2002，85:2 015-2 022.

[4] Well J E，Russell J B.Why do many ruminal bacteria die and lyse so quickly[J].Journal of Dairy Science，1996，79:1 487-1 495.

[5] Menke K H，Steingass H.Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid[J].Animal Research and Development，1988，28:47-55.

[6] 王夢芝，王洪榮，曹恒春，等.特定氨基酸缺省底物對體外培養(yǎng)混合瘤胃微生物及其發(fā)酵的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41(7):2 136-2 142.

[7] Clark J H，Klusmeyer T H，Cameron M R.Symposium:nitrogen metabolism and amino acid nutrition in dairy cattle[J].Journal of Dairy Science，1992，75:2 304-2 323.

[8] Zhou J，Bruns M A，Tiedje J M.DNA recovery from soils of diverse composition[J].Applied and Environmental Microbiology，1996，62(2):316-322.

[9] Chen G，Sniffen C J，Russell J B.Fermentation of peptides and amino acids by monensin-sensitive ruminal pep2 to streptococcus[J].Applied and Environmental Microbiology，1988，54:2 742-2 749.

[10] Atasoglu C，Guliye A Y，Wallace R J.Use of stable isotopes to measure de novo synthesis and turnover of amino acid-C and-N in mixed micro-organisms from the sheep rumen in vitro[J].British Journal of Nutrition，2004，91:235-261.

[11] Kristensen S.Ruminal biosynthesis of aromatic amino acids from arylacetic acids，glucose，shikimic acid and phenol[J].British Journal of Nutrition，1974，31:357-365.

[12] Sauer F D，Erfle J D，Mahadevan S.Amino acid biosynthesis in mixed rumen cultures[J].Journal of Biochemistry，1975，150:357-372.

[13] Salter D N，Daneshvar K，Smith R H.The origin of nitrogen incorporated into compounds in the rumen bacteria of steers given protein-and urea-containing diets[J].British Journal of Nutrition，1979，41:197-209.