印遇龍 李鐵軍 吳 信 徐海軍

(湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心,中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,長沙410125)

腸道既是動物消化食物、吸收營養(yǎng)的主要場所,也是體內(nèi)最大的免疫器官。然而,由于斷奶后仔豬面臨飼料和環(huán)境等各種外界因素的應激,使得仔豬常常出現(xiàn)食欲差、消化功能紊亂,從而導致腸道屏障受損,腸絨毛萎縮,隱窩深度加大,進而出現(xiàn)腹瀉和生長緩慢的現(xiàn)象。斷奶應激是造成腸道受損的主要原因,同時也是實施早期斷奶的最大技術(shù)障礙[1-3]。目前,通過研究揭示仔豬腸道的發(fā)育規(guī)律,并通過維持仔豬腸道健康來緩解仔豬斷奶應激造成的負面影響,已成為現(xiàn)代營養(yǎng)學研究的熱點之一。

1 傳統(tǒng)營養(yǎng)學對斷奶仔豬消化生理特點的研究

仔豬的腸道消化在斷奶前,其營養(yǎng)全部或部分由母乳提供,豬母乳中含有豐富的脂肪和易于消化的酪蛋白;斷奶后仔豬的營養(yǎng)來源從液體飼料轉(zhuǎn)成固體飼料,仔豬消化道酶系統(tǒng)和生理環(huán)境等均不適應,其結(jié)果表現(xiàn)在臨床上為斷奶仔豬采食量和飼料利用率降低,消化不良和引起腹瀉的發(fā)生。影響早期斷奶仔豬生產(chǎn)性能的主要因素有:1)胃酸分泌不足,消化酶分泌不足,小腸吸收功能減弱,腸道絨毛萎縮和隱窩增生;2)不能從母乳中得到有益因子,飼料采食量下降,水攝入量不足以及日糧蛋白質(zhì)的抗原性,這些都會對仔豬腸道帶來損傷[4]。

仔豬因腸道內(nèi)尚未建立穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng),自身抵抗力較低,對外界刺激敏感,易受各種病原微生物的侵襲和各種應激因素的影響。哺乳仔豬以傳染性腹瀉較為常見,而保育仔豬以日糧抗原過敏、斷奶、飼料突然更換和應激等非傳染性因素引起的腹瀉為主。仔豬腹瀉的發(fā)病機制十分復雜,單一因素、復合因素都可促使發(fā)病。在所有的應激源之中,營養(yǎng)應激是最主要的[4]。

腸道形態(tài)學的變化(絨毛高度和陷窩深度)是引起功能上的改變和腸道吸收機能降低的主要原因[5-6],仔豬在應激條件下會產(chǎn)生過敏反應,使得腸細胞有絲分裂速度加快,隱窩深度增加[2-3]。當腸細胞向絨毛的遷移速度加快后,頂端腸細胞的脫落速度增快,成熟腸細胞損失加劇。由于它們的吸收和消化能力都較高,成熟細胞數(shù)量的減少會導致酶活性和吸收能力下降。這些變化與腸道營養(yǎng)物質(zhì)周轉(zhuǎn)速度加快和消化不良密切相關(guān),而且很可能使小腸對病原微生物(如大腸桿菌)的敏感性提高,進而導致腸道組織的進一步損傷。

2 現(xiàn)代營養(yǎng)學對腸道健康的研究

2.1 利用基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學技術(shù)手段研究仔豬腸道功能發(fā)育與調(diào)控

Wang等[8]、Chen等[7]和Wang等[9]將基因組學和蛋白質(zhì)組學等技術(shù)應用于仔豬研究,利用豬的全基因組芯片技術(shù)研究了宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation,IUGR)與正常發(fā)育仔豬腸道黏膜基因表達變化(圖1),檢測了4萬多個基因的表達變化情況,同時利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究了哺乳和斷奶仔豬腸道黏膜上皮組織蛋白變化(圖2),分析了組織中數(shù)千個蛋白質(zhì)的水平高低[7]。結(jié)果表明斷奶引發(fā)了與氧化應激和免疫激活相關(guān)的21個基因(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶ω-1、HMG-CoA合成酶、細胞色素 P450、角鯊烯環(huán)氧化酶、溶菌酶、nudix水解酶-5、免疫球蛋白受體前體、Igα-鏈C、Ig J-鏈、Igκ-鏈 C、Igλ-鏈、水通道蛋白 8、N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷2-α-L-巖藻苷轉(zhuǎn)移酶、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶、3-β-羥基類固醇-δ8-δ7-異構(gòu)酶、C-4甲基固醇氧化酶、C-4甲基固醇氧化酶-2、纖溶酶原激活子誘導的c54、法呢基焦磷酸合酶以及septin 5)表達上調(diào)及與營養(yǎng)代謝和細胞增殖相關(guān)的18個基因(乙酰-CoA脫氫酶、N-乙酰-D-葡萄糖胺異構(gòu)酶2、ADP-核糖基化因子GTP酶激活蛋白I、氨基肽酶A、泛素羧基端水解酶、組織蛋白酶F、阿樸脂蛋白A-Ⅳ、肉堿轉(zhuǎn)運子2、脂肪酸結(jié)合蛋白、甾醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白10、鈉和氯離子依賴的肌氨酸轉(zhuǎn)運子Ⅰ、DNA結(jié)合蛋白抑制子ID-2、腺苷酸環(huán)化酶、IGF-Ⅱ、白細胞抗原相關(guān)蛋白、前甘丙肽原、生長激素抑制素和vanin-1)表達下降。同時,斷奶引起DNA結(jié)合蛋白抑制子ID-2(-81%)、IGF-Ⅱ(-77%)、泛素羧基端水解酶 FAF-Y(-92%)、生長激素抑制素(-83%)和 vanin(-87%)表達量的下降,以及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶ω-1(+215%)、HMG-CoA 合成酶(+63%)、水通道蛋白8(+315%)和溶菌酶(+278%)表達的上調(diào)。

本課題組基于NMR的代謝組學方法研究了日糧添加精氨酸對豬血清代謝組的調(diào)控作用(圖3)[10-11],為研究營養(yǎng)素對動物機體的作用提供的新的研究途徑,所得數(shù)據(jù)也與生物的表型或整體狀況的距離最近,是生物學現(xiàn)象的最直接表現(xiàn)[10]。研究結(jié)果表明,精氨酸可顯著調(diào)控豬血清代謝組學特征。胴體系數(shù)表明,日糧中添加精氨酸能減少機體的脂肪沉積和增加蛋白質(zhì)合成。血清代謝物的主要成分分析表明,與對照組相比,精氨酸添加降低了血清低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和尿素的濃度,提高了肌酐、三羧酸循環(huán)代謝物、丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸和酪氨酸的濃度(圖3)。另外,精氨酸添加影響了甘油磷酸膽堿和肌醇等脂蛋白信號分子和甲酸、乙醇、甲胺、二甲胺、乙酸和丙酸等胃腸道菌群代謝物。這些新的發(fā)現(xiàn)表明,日糧中添加1%精氨酸能影響機體內(nèi)的脂肪和氨基酸代謝,增強骨骼肌的蛋白質(zhì)合成和調(diào)控胃腸道菌群的代謝。

圖3 核磁共振技術(shù)測定的仔豬血清樣品中600 MHz 1H NMR CPMG(A)、NOESY(B)和DPP-LED(C)的圖譜Fig.3 Typical 600 MHz 1H NMR CPMG(A),NOESY(B)and DPP-LED(C)spectrum of serum taken from asuckled piglet

2.2 仔豬哺乳期腸道黏膜發(fā)育變化規(guī)律

哺乳仔豬腸道黏膜發(fā)育狀況對早期斷奶仔豬的營養(yǎng)吸收和腸道健康至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)哺乳仔豬腸絨毛高度和隱窩深度變化范圍及其發(fā)育規(guī)律,即腸絨毛高度在空腸前段、空腸后段和回腸末端分別為154.78～235.45 mm、142.67～279.82 mm、177.22～277.60 mm,其發(fā)育趨勢表現(xiàn)為空腸前段、空腸后段和回腸末端分別呈二次方曲線、四次方曲線和線性變化;隱窩深度在空腸前段、空腸后段和回腸末端分別為 100.21～167.87 mm、97.37～201.90 mm 、101.64～195.35 mm,其發(fā)育趨勢表現(xiàn)為空腸前段、空腸后段和回腸末端分別呈二次方曲線、線性和二次方曲線變化。這些發(fā)現(xiàn)為我們研究營養(yǎng)素對腸道發(fā)育的影響提供了重要參照指標[12]。

2.3 哺乳仔豬腸道功能性基因發(fā)育變化規(guī)律

通過克隆豬腸道氨基酸轉(zhuǎn)運載體ASCT2、B0、b0+AT和y+LAT1,以及小肽轉(zhuǎn)運載體Pep T1的cDNA編碼區(qū),并在發(fā)現(xiàn)Pep T1 cDNA長度為2 127 bp,預測蛋白質(zhì)編碼708個氨基酸,二級結(jié)構(gòu)具有典型的膜蛋白結(jié)構(gòu),包括13個跨膜結(jié)構(gòu)域,其中第10和11跨膜結(jié)構(gòu)間存在一個大的胞外環(huán);氨基酸的主要轉(zhuǎn)運載體y+LAT1和b0+AT的cDNA長度分別為1 536和1 464 bp,預測蛋白質(zhì)編碼分別為511和487個氨基酸,二級結(jié)構(gòu)均包括12個跨膜結(jié)構(gòu)域。通過對氨基酸轉(zhuǎn)運載體的研究,為進一步利用營養(yǎng)素調(diào)節(jié)載體表達奠定了試驗基礎(chǔ)[13]。

通過研究堿性磷酸酶(腸黏膜上的標志酶,可反映腸道的發(fā)育情況及腸上皮細胞的吸收能力)在腸道的分布,表明仔豬不同哺乳日齡和腸道部位堿性磷酸酶及功能性基因mRNA表達變化規(guī)律,即在空腸前段堿性磷酸酶、中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體ASCT1、堿性氨基酸轉(zhuǎn)運載體CAT1和小肽轉(zhuǎn)運載體Pep T1基因mRNA表達量發(fā)育趨勢呈四次方曲線變化,在空腸后段堿性磷酸酶和中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體ASCT1分別呈線性和二次方曲線變化,在回腸末端堿性磷酸酶、中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體ASCT1、堿性氨基酸轉(zhuǎn)運載體CAT1、酸性氨基酸轉(zhuǎn)運載體EAAC1和小肽轉(zhuǎn)運載體Pept1的發(fā)育趨勢分別呈二次方曲線、線性、四次曲線、三次曲線和二次曲線變化。這些結(jié)果的發(fā)現(xiàn)從分子水平上揭示了仔豬腸道氨基酸和肽的轉(zhuǎn)運和吸收機制[12]。

2.3 仔豬斷奶應激造成腸道結(jié)構(gòu)與功能變化的分子機制

本實驗室通過研究發(fā)現(xiàn),早期斷奶應激顯著改變調(diào)控腸道代謝功能關(guān)鍵基因的表達,其中與氧化應激和免疫激活相關(guān)的21個基因表達上調(diào)(52%～346%),與大分子營養(yǎng)代謝和細胞增殖相關(guān)的18個基因表達下降(35%～77%)[7]。近年來,應激蛋白70(HSP70)已成為研究外部應激對腸道影響的一個重要指標,通過試驗研究,發(fā)現(xiàn)HSP70主要在腸道黏膜表層表達,對維持腸道黏膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性起著重要作用。斷奶應激使腸道HSP70含量迅速增加。另外,利用大腸桿菌脂多糖(LPS)建立了仔豬斷奶應激引起腸道損傷的模型,斷奶應激刺激仔豬腸道炎性介質(zhì)(如 IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細胞因子)的過量表達,引起腸黏膜上皮細胞增殖/凋亡的動態(tài)平衡紊亂,從而導致腸道結(jié)構(gòu)和功能嚴重受損[14]。

2.4 宮內(nèi)發(fā)育遲緩影響新生仔豬小腸功能的分子機制

IUGR是家畜生產(chǎn)中的主要問題之一。利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)IUGR仔豬空腸中306個基因上調(diào)(變化倍數(shù)≥2),271個基因下調(diào)(變化倍數(shù)≥2);利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)IUGR降低了調(diào)控免疫功能(免疫球蛋白、膜聯(lián)蛋白AⅠ)、氧化防御(過氧化物酶1、轉(zhuǎn)鐵蛋白、z-晶體蛋白)、中間代謝(肌酸激酶、乙醇脫氫酶、L-乳酸脫氫酶、前列腺素 F合酶、載脂蛋白AⅠ、兒茶酚甲基轉(zhuǎn)移酶、磷酸甘油酸酯激酶)、蛋白質(zhì)合成(真核生物翻譯起始因子-3)和組織生長(β-肌動蛋白、結(jié)合蛋白、角蛋白10)等組織特異蛋白的水平,增加了與蛋白質(zhì)水解(蛋白酶α-5與 α-1亞基)、氧化應激(清道夫受體蛋白、α-1酸性糖蛋白)和ATP水解(F1-ATP酶)有關(guān)蛋白質(zhì)的水平。上述發(fā)現(xiàn)表明,細胞信號轉(zhuǎn)導異常、氧化還原失衡、蛋白質(zhì)合成減少以及蛋白質(zhì)水解增加都是影響子宮發(fā)育遲緩仔豬營養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝紊亂以及小腸生長發(fā)育受阻的主要機制[15]。

3 功能性氨基酸和植物提取物對腸道健康的影響作用

精氨酸可有效促進仔豬腸道發(fā)育[16],促進蛋白質(zhì)的合成[17],顯著促進血管內(nèi)皮生長因子在腸道中的表達[16-17],谷氨酰胺可增加與細胞生長及清除氧化物相關(guān)的基因表達,減少與氧化應激和免疫激活相關(guān)的基因表達,藥用植物提取物可通過提高仔豬內(nèi)源性精氨酸的合成促進腸道健康。建立了以精氨酸家族及其代謝物(N-氨甲酰谷氨酸、α-酮戊二酸、精胺)、植物提取物和過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)為基礎(chǔ)的關(guān)鍵調(diào)控技術(shù)體系。

3.1 精氨酸家族及其代謝物(N-氨甲酰谷氨酸、α-酮戊二酸、精胺)對緩解仔豬斷奶應激的作用

細胞中HSP70對維持腸道黏膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性起著重要作用,精氨酸和N-氨甲酰谷氨酸(NCG)均通過 NO-HSP70途徑,提高HSP70表達量,且NCG可以有效維持斷奶仔豬腸道黏膜結(jié)構(gòu)完整性,緩解仔豬斷奶應激的作用[18],而精氨酸可通過PPARγ信號途徑發(fā)揮緩解腸道損傷的作用,通過激活PPARγmRNA的表達而緩解LPS刺激導致的腸道炎性細胞因子的過量產(chǎn)生,從而緩解腸道損傷[19]。α-酮戊二酸能夠促進仔豬生長,有效緩解LPS慢性免疫應激引起的仔豬生產(chǎn)性能的下降,抑制LPS刺激引起的空腸黏膜蛋白合成的減少和抗氧化能力的降低,維持腸道屏障完整性[20]。精胺可提高斷奶仔豬小腸絨毛高度和空腸麥芽糖酶活性,降低隱窩深度,使小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)與吸收功能得到改善,其作用效果具有后續(xù)性。日糧中添加1%的精氨酸可以顯著促進血管生長(血管內(nèi)皮生長因子在十二指腸,空腸和回腸中的表達分別提高25%、30%和35%)和腸道的發(fā)育,日增重提高 18.5%,飼料轉(zhuǎn)化率提高12.8%[21]。給哺乳仔豬灌服NCG,其血漿精氨酸濃度分別增加了68%和32%。在斷奶仔豬飼料中添加0.08%的NCG,平均日采食量提高20%;平均日增重提高19%,腹瀉率由15.8%下降為2.9%[22]。

3.2 谷氨酰胺調(diào)控仔豬斷奶應激的作用機制

腸道谷氨酰胺供應不足,導致不能及時合成所需的谷胱甘肽,使腸道細胞氧化狀態(tài)惡化,處于應激和免疫激活狀態(tài),生長增殖受限[23-24]。本項目發(fā)現(xiàn),谷氨酰胺增加了細胞生長及清除氧化物相關(guān)的6個基因(羊水因子-9、信號識別粒子、亞鐵血紅素結(jié)合蛋白、內(nèi)源性苯甲二氮、IL-13R-α-1和肌漿球蛋白)的表達,而減少了氧化應激和免疫激活相關(guān)的8個基因(TGFβ誘導的早期生長反應蛋白Ⅰ、酪蛋白激酶、胞間粘附分子、la蛋白、MAPK-6、肽基脯氨酰異構(gòu)酶、Rho相關(guān)的GTP結(jié)合蛋白和mRNA剪切復合體蛋白Ⅱ)的表達。添加谷氨酰胺下調(diào)了酪蛋白激酶I(-34%)、MAPK-6(-67%)和 TGF β誘導的早期生長反應蛋白I(-51%)等基因的表達。在日糧中添加1%谷氨酰胺可增加細胞生長和氧化劑移除必需基因的表達(120%～124%),降低氧化應激和免疫激活促進基因的表達(34%～75%);增強斷奶仔豬腸道的氧化防御能力(血清中的谷胱甘肽濃度增加29%),防止空腸黏膜萎縮(空腸絨毛高度增加38%),提高仔豬小腸重量12%,體重增加19%,斷奶后第2周飼料轉(zhuǎn)化率增加25%[8]。

3.3 藥用植物提取物通過提高仔豬內(nèi)源性精氨酸的合成促進腸道健康

藥用植物提取物通過提高仔豬體內(nèi)內(nèi)源性精氨酸的合成促進腸道的健康。藥用植物超微粉顯著提高血清氨基酸濃度10%～50%(精氨酸濃度提高9.9%～22.0%),顯著提高氨基酸消化率10%～15%(精氨酸消化率提高7.9%～9.4%);刺五加提取物顯著提高血清氨基酸濃度15.3%～80.8%(精氨酸濃度提高20%～31%),顯著提高氨基酸消化率4.1%～30.8%(精氨酸消化率提高15%～31%)[25]。

本實驗室研究結(jié)果表明,藥用植物超微粉能極顯著提高斷奶仔豬全期平均日增重(18.77%),顯著降低料重比(11.49%),腹瀉率降低 14.65%～23.33%,顯著提高淋巴細胞百分率12.8%～26.7%、淋巴細胞增殖活性4.6%～12.6%;刺五加提取物能極顯著提高斷奶仔豬全期平均日增重(12.92%),顯著降低全期料重比(18.89%),顯著降低腹瀉率24.55%～27.35%,顯著提高淋巴細胞百分率13.2%～17.9%、淋巴細胞增殖活性5.7%～12.8%。該類植物提取物抗斷奶應激效果優(yōu)于抗生素或與其相當,可有效替代抗生素用于防止仔豬斷奶應激。其抗斷奶應激效果優(yōu)于抗生素或與其相當,可有效替代抗生素用于防止仔豬斷奶應激[26-27]。

4 促進仔豬腸道健康及替代抗生素和激素的系列功能性產(chǎn)品的研發(fā)與應用

針對仔豬的生理特點,本實驗室開發(fā)出精氨酸生素、乳化脂肪、乳豬誘食劑、斷奶整腸劑、大米蛋白粉、大米糖漿、藥用植物復方、藥用植物超微粉和刺五加提取物等調(diào)控劑,并研制生產(chǎn)出高效、安全、低成本的乳豬料系列產(chǎn)品[28-31]。

4.1 仔豬料系列產(chǎn)品特點

(1)具有高度生物安全性:通過添加腸道上皮細胞營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑(精氨酸、精氨酸生素、谷氨酰胺等),并與大米蛋白粉、大米糖漿、乳清蛋白等結(jié)合使用,使仔豬的生產(chǎn)性能達到或超過血漿蛋白的使用效果,完全可以替代血漿蛋白等同源動物蛋白的使用。

(2)適口性好,消化率高:大米糖漿為不同糖基數(shù)的混合糖,甜度高、適合消化道對淀粉的消化與吸收規(guī)律,提高了斷奶仔豬對糖的利用率;植物油脂的乳化,大大提高了斷奶階段仔豬對脂肪的利用率,如50%乳化脂肪的生產(chǎn)性能明顯高于100%的大豆油,平均日采食量增加 10～20 g,日增重提高10.6%～17.6%。

(3)仔豬抗病能力強:中藥提取物的使用,提高了仔豬機體的免疫力,緩解或消除了免疫抑制因子,減少了病毒性疾病的發(fā)生和對抗生素的依賴,保障了仔豬的健康生長。

(4)腹瀉率低:通過腸道上皮細胞營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑的使用,促進了腸道絨毛的發(fā)育,提高了腸道對營養(yǎng)素的消化利用率,減少了斷奶應激造成的腸道機能紊亂與腹瀉的發(fā)生率,腹瀉率下降25.7%～30.0%,減少了對抗生素、高銅、高鋅的依賴。

4.2 仔豬調(diào)控劑特點

(1)斷奶整腸劑:緩解仔豬斷奶應激。一方面,通過給細胞提供能量源,刺激受損小腸絨毛膜的修復,對仔豬腸道提供保護,從而提高其消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力,抑制病原菌(如大腸桿菌等)的生長;另一方面,通過黏附作用,有效防止腸毒素(大腸桿菌)對腸上皮細胞的進一步入侵,從而維持斷奶仔豬腸道健康。

(2)乳豬誘食劑:通過調(diào)節(jié)采食中樞,促進乳豬下丘腦神經(jīng)肽Y的分泌,達到強誘食目的,同時還具有促進有益菌生長,抑制有害菌繁殖,保持腸道微生態(tài)平衡和增強胃腸道消化酶的分泌,從而提高仔豬健康水平。

(3)乳化脂肪:采取特殊工藝(高壓乳化,膠體磨、均質(zhì)機30～40 Mpa)將油脂制備成粒徑 1～3μm的脂肪球,以水溶性大米糖漿為包壁材料,形成微囊化的乳化脂肪。該產(chǎn)品乳化效果好,與水互溶后24 h懸浮率大于95%。該產(chǎn)品的消化吸收率達95%,而普通豆油的消化吸收率僅為43.4%,棕櫚油(脂肪粉)的消化吸收率更低,只有23%。在與飼料配合時可以提高油脂含量(可高達30%～50%,而液態(tài)油脂的添加量不超過8%),為配制高能飼料提供了技術(shù)儲備,特別適應于寒冷和熱應激狀態(tài)。

5 小 結(jié)

綜上所述,通過研究仔豬在斷奶前后腸道變化的規(guī)律,闡明其變化的機理,對指導配方設(shè)計和研發(fā)新型的功能性飼料具有十分重要的意義,其研究成果也必將具有廣闊的應用前景。

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