隋汝波，張 磊，臧麗娥

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

紅景天對卒中后抑郁大鼠海馬細胞因子干預(yù)作用的實驗研究*

隋汝波1△，張 磊2，臧麗娥1

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

目的:探討紅景天對卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)大鼠海馬細胞因子的干預(yù)作用。方法:各組進行行為學(xué)觀察和測試、海馬組織HE染色及TNF-α、IL-1β、IL-6含量測定。結(jié)果:與PSD組比較，紅景天低、中、高劑量組均能不同程度減少海馬組織TNF-α、IL-1β含量而提高IL-6的含量，減少海馬神經(jīng)細胞的受損程度，提高抑郁的行為學(xué)評分。其中，中、高劑量組較低劑量組作用更明顯。結(jié)論:PSD大鼠海馬組織細胞因子網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變，紅景天對PSD大鼠海馬有保護作用。

卒中后抑郁;海馬;細胞因子;紅景天

PSD是腦卒中后的一個常見的并發(fā)癥，顯著增加了卒中患者的病死率、致殘率，降低了患者的生存質(zhì)量，給患者及其家庭乃至社會帶來了十分沉重的負擔(dān)，已越來越引起學(xué)者的關(guān)注。目前雖已有各種藥物用于臨床，但療效均不理想，無效率仍高達20%～40%［1］。近年的研究提出海馬損傷及炎癥因素參與了PSD的發(fā)生發(fā)展，故如果能減少PSD時的海馬損傷及穩(wěn)定細胞因子網(wǎng)絡(luò)，將能夠有效治療PSD。

紅景天已有多年臨床應(yīng)用經(jīng)驗，在治療缺血性心臟病及缺血性腦血管病等方面已取得了良好療效。對其在 PSD中的作用國內(nèi)報道少見，而其對PSD時海馬組織細胞因子的影響更尚未見報道。本文根據(jù)紅景天免疫雙向調(diào)節(jié)功能的中醫(yī)理論，觀察其對大鼠PSD時海馬組織細胞因子 TNF-α、IL-6及IL-1β水平的影響，以及海馬組織的改變及其對PSD大鼠行為學(xué)的影響，從而為PSD的治療提供新的思路及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用健康普通級雄性SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠 60 只，體重 180g～240g，遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號 SCXK(遼)。

1.1.2 藥品和試劑 紅景天購于吉林白山市藥材責(zé)任有限公司，IL-1β、TNF-α、IL-6試劑盒購自天津千葉生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器 DH-I型動物人工呼吸機:浙江醫(yī)科大學(xué)儀器試驗廠;低速離心機:北京醫(yī)用離心機廠;BH6018型四探頭自動r計數(shù)器:北京核儀器廠;電子天秤:上海天平儀器廠;連續(xù)變倍體視顯微鏡160x:桂林儀器廠;石英自動雙重純水蒸餾器:江蘇丹陽門石英玻璃廠;LEICA-RM-2135石蠟切片機:德國;烘片、烤片機:孝感市電子儀器廠;OLYMPUS萬能顯微鏡:日本;CIAS-1000型 T圖像分析儀:北京大恒圖像視覺有限公司;電熱干燥箱:余姚工業(yè)儀表二廠。

1.2 方法

1.2.1 分組 遵循隨機原則，將72只大鼠分為單純?nèi)毖M、PSD組、氟西汀組和3個劑量的紅景天組，每組12只。紅景天組紅景天分別按生藥2.5g/kg/d、5g/kg/d、7.5g/kg/d 溶于 2 ml生理鹽水中，灌胃給藥21d，余各組每天以同樣給藥途徑給予等劑量的生理鹽水，灌胃21d。

1.2.2 大鼠局灶性腦缺血模型的建立［2］

(middle cerebral artery occlusion，MCAO)手術(shù)前 12h禁食不禁水。選用標(biāo)準(zhǔn)大鼠麻醉劑量，以10%水合氯醛3ml·kg－1，經(jīng)腹腔麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部正中切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露左側(cè)頸總動脈(CCA)和迷走神經(jīng)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)、ICA的顱外分支——翼腭動脈，在近心端結(jié)扎 CCA，在頸總動脈分叉處結(jié)扎ECA，結(jié)扎翼腭動脈。將ICA遠心端用動脈夾夾閉，距頸總動脈分叉處近心端0.5cm處將頸總動脈剪一小口，插入備好的碳素魚線，去除動脈夾，沿著ICA輕輕向前推進，注意不要誤入翼鄂動脈，當(dāng)?shù)竭_指定長度(18 mm左右)時結(jié)扎ICA并固定魚線。假手術(shù)組動物，除手術(shù)過程中不插入線栓以外，其他過程相同。以青霉素局部消毒后縫合皮膚，術(shù)后保持環(huán)境溫度在25℃ ～30℃左右。尤其要注意動物頭部的保溫。模型成功的標(biāo)志是大鼠即刻出現(xiàn)右側(cè)Horner征。

1.2.3 大鼠卒中后抑郁模型的制備 CUMS:按willner和 Katz方法:①禁食禁水 20h;②禁水17h;③傾斜鼠籠45°17h;④持續(xù)光照17h;⑤濕籠(100g鋸屑+200ml水)21h;⑥4℃游泳 5min;⑦水平搖晃5min;⑧行為限制2h;⑨夾尾1min 9種刺激每天隨機采取1種共21d;⑩孤養(yǎng):將PSD和抑郁組動物單籠飼養(yǎng)。

1.2.4 行為學(xué)觀察和測試 CUMS后第1、7、14、21天行曠野實驗測試，每周行蔗糖水實驗并測量體重。(1)曠野實驗:室內(nèi)隔音，測定5min水平及垂直運動得分;(2)蔗糖水實驗:20h禁食禁水后，測定1h糖水飲用比例(糖水消耗/總液體消耗 ×100%);(3)體重測量:每周測量各組體重。

1.2.5 HE染色 大鼠以10%水合氯醛(0.3ml.100mg－1)腹腔注射麻醉，打開頸部暴露頸右總動脈，插管，先輸注生理鹽水約50ml，然后輸注4%多聚甲醛約50ml，斷頭取腦。甲醛固定，冠狀腦片制備，選擇梗死中心(即最大層面)，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，制成 4μm ～6μm 厚的切片，附片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，分別觀察梗死中心區(qū)、梗死周邊區(qū)腦組織(海馬CAl、CA3區(qū))，前述區(qū)域神經(jīng)細胞和血管內(nèi)皮細胞(每個觀察區(qū)選擇具有代表性標(biāo)本觀察結(jié)果并記錄)。

1.2.6 放射免疫法檢測海馬組織IL-1β、TNF-α、IL-6的含量 21d后各組每只分別迅速斷頭，剝離出腦，在冰浴下迅速分離海馬組織，制備組織勻漿，3000r/min離心15min，吸取上清液采用放射免疫分析法檢測細胞因子，實驗按說明書操作。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)計量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異非常顯著。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察和測試

表1 各組PSD大鼠體重比較(±s，g)

表1 各組PSD大鼠體重比較(±s，g)

注:經(jīng)方差分析與兩兩比較，與假手術(shù)組比較:aP>0.05，bP<0.01，cP<0.05;與單純?nèi)毖M比較:dP>0.05，fP<0.01;與 PSD組比較:eP<0.05，gP>0.05，iP<0.01;與低劑量組比較:jP>0.05，kP<0.05，lP<0.01;與氟西汀組比較:nP>0.05，rP<0.05;與中劑量組比較:mP>0.05

組別第1天 第7天 第14天 第21天假 手 術(shù) 組 278.7±22.5 279.6±23.8 293.7±20.9 304.6±25.8單 純 缺 血 組 279.4±28.3a 289.7±26.2a 307.5±27.2b 311.4±26.6c PSD 組 284.5±23.2d 285.9±25.1d 266.1±12.1f 261.0±21.7f氟 西 汀 組 281.3±21.3g 281.0±21.5g 297.2±26.3i 311.2±22.1i紅 景 天 低 劑 量 組 278.5 ±27.4g，n 279.4 ±20.3g，n 281.3 ±23.7e，r 285.2 ±31.7e，r紅 景 天 中 劑 量 組 279.7 ± 23.7g，j，n 280.0 ± 30.9g，j，n 296.8 ± 21.5i，k，n 306.9 ± 27.5i，k，n紅 景 天 高 劑 量 組 281.6 ± 20.6g，j，n，m 279.7 ± 25.9g，j，n，m 295.1 ± 23.5i，l，n，m 310.8 ± 22.9i，l，n，m

表2 各組PSD大鼠糖水消耗量比較(±s，ml)

表2 各組PSD大鼠糖水消耗量比較(±s，ml)

注:經(jīng)方差分析與兩兩比較，與假手術(shù)組比較:bP<0.05，cP>0.05;與單純?nèi)毖M比較:fP<0.01;與 PSD組比較:gP>0.05，eP<0.05，iP<0.01;與低劑量組比較:jP>0.05，hP<0.05，lP<0.01;與氟西汀組比較:nP>0.05，rP<0.05;與中劑量組比較:mP>0.05

組別第1天 第7天 第14天 第21天假 手 術(shù) 組39.4±5.5 40.6±4.3 38.6±4.7 38.8±4.6單 純 缺 血 組 34.6±8.5c 38.3±6.2c 35.6±4.3c 30.3±4.4b PSD 組 23.7±6.3f 20.5±3.9f 17.6±9.0f 10.5±3.4f氟 西 汀 組 23.9±4.5g 25.2±5.2g 31.1±6.3e 33.2±3.6i紅 景 天 低 劑 量 組 22.4 ±4.9g，n 23.0 ±6.5g，n 25.6 ±2.6e 27.6 ±7.7i，n紅 景 天 中 劑 量 組 23.7 ± 2.6g，j，n 25.0 ± 7.9g，j，n 29.8 ± 6.5e，h，n 34.9 ± 3.5i，l，n紅 景 天 高 劑 量 組 22.6 ± 5.0g，j，n，m 24.7 ± 3.5g，j，n，m 30.1 ± 6.2e，h，n，m 32.8 ± 4.9i，l，n，m

表3 各組PSD大鼠曠野實驗水平運動得分比較(±s，次/5min)

表3 各組PSD大鼠曠野實驗水平運動得分比較(±s，次/5min)

注:經(jīng)方差分析與兩兩比較，與假手術(shù)組比較:cP<0.01;與單純?nèi)毖M比較:fP<0.01;與 PSD組比較:gP>0.05，iP<0.01;與低劑量組比較:jP>0.05，lP<0.05，kP<0.01;與氟西汀組比較:nP>0.05，rP<0.05;與中劑量組比較:mP>0.05

組別第1天 第7天 第14天 第21天假 手 術(shù) 組51.3±4.5 6.4±3.1 58.2±2.9 59.6±5.2單 純 缺 血 組 43.4±7.5c 48.3±4.2c 44.6±5.3c 41.3±4.6c PSD 組 29.7±2.3f 23.5±2.3f 19.6±1.9f 15.5±2.4f氟 西 汀 組 28.3±3.2g 28.9±3.2g 39.3±2.1i 39.1±1.3i紅 景 天 低 劑 量 組 27.4 ± 2.6g，n 28.0 ±1.9g，n 29.6 ±2.1i，r 30.6 ± 1.7i，r紅 景 天 中 劑 量 組 28.7 ± 1.6g，j，n 29.4 ± 3.0g，j，n 38.8 ± 0.5i，l，n 38.9 ± 1.5i，k，n紅 景 天 高 劑 量 組 27.6 ± 4.6g，j，n，m 28.7 ± 0.5g，j，n，m 36.1 ± 2.5i，l，n，m 37.8 ± 2.6i，l，n，m

表1～3顯示，與單純?nèi)毖M相比，PSD組大鼠體重和糖水消耗量下降，水平運動及垂直運動水平降低(P<0.01);氟西汀組大鼠體重和糖水消耗量增多，水平運動及垂直運動水平提高(P<0.01);紅景天各組均可以增加PSD大鼠體重和糖水消耗量，提高水平運動及垂直運動水平，其中中、高劑量組較低劑量組效果更明顯 (P<0.01)，但2組間無明顯差異(P>0.05)。且中、高劑量紅景天組與氟西汀組相比，無明顯差異(P>0.05)。

2.2 海馬CA1區(qū)腦組織病理形態(tài)學(xué)

HE染色(×400)光學(xué)顯微鏡下觀察，每組均可見正常神經(jīng)元和損傷神經(jīng)元。正常神經(jīng)元核圓形，邊界及核仁清楚;損傷神經(jīng)元胞核腫大、偏位，核仁消失，胞漿著色淺、蒼白或核濃縮、深染，細胞呈三角形缺血性壞死變化。損傷神經(jīng)元上述特點在PSD組表現(xiàn)得最明顯;紅景天組與氟西汀組均能不同程度地改善神經(jīng)細胞的核深染、核固縮程度，減少細胞及間質(zhì)的水腫，使胞膜清楚、形態(tài)正常、核仁清晰可見的神經(jīng)細胞數(shù)目增多。

2.3 海馬組織 TNF-α、IL-1β、IL-6的含量

表4顯示，與單純?nèi)毖M相比，PSD組 TNF-α、IL-1β含量明顯增加而 IL-6的含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與PSD組相比，氟西汀組與紅景天各組均降低 TNF-α、IL-1β的含量而提高 IL-6含量(P<0.01);其中，中、高劑量組較低劑量組效果更明顯(P<0.05)，2組間無明顯差異(P>0.05)。而中、高劑量紅景天組與氟西汀組相比，無明顯差異(P>0.05)。

表4 各組PSD大鼠海馬組織細胞因子含量比較(±s，)

表4 各組PSD大鼠海馬組織細胞因子含量比較(±s，)

注:經(jīng)方差分析與兩兩比較，與假手術(shù)組比較:bP<0.05，與單純?nèi)毖M比較:fP<0.01;與 PSD組比較:iP<0.01;與低劑量組比較:kP<0.05，lP<0.01;與氟西汀組比較:nP>0.05，rP<0.05;與中劑量組比較:mP>0.05

組別 TNF-α(ng/ml) IL-1β(pg/ml) IL-6(pg/ml)假 手 術(shù) 組0.69±0.3 0.17±0.4 152.50±3.7單 純 缺 血 組 0.95±0.1b 0.28±0.1b 121.80±7.7b PSD 組 1.66±0.3f 0.83±0.2f 80.30±5.9f氟 西 汀 組 1.02±0.3i 0.32±0.4i 138.40±6.2i紅 景 天 低 劑 量 組 1.27 ± 0.1i，r 0.62 ± 0.6i，r 113.60 ± 5.8i，r紅 景 天 中 劑 量 組 1.15 ± 0.5i，l，n 0.48 ± 0.3i，l，n 128.90 ± 1.5i，k，n紅 景 天 高 劑 量 組 1.09 ± 0.2i，l，n，m0.37 ± 0.5i，l，n，m 137.80 ± 0.9i，l，n，m

3 討論

3.1 PSD的發(fā)病機制仍不明確，多種學(xué)說并存

研究證實，中度抑郁患者海馬體積減少，并可被抗抑郁藥逆轉(zhuǎn)，從而提出了海馬神經(jīng)再生障礙假說。近年來有研究顯示，細胞因子網(wǎng)絡(luò)的異常有可能參與PSD的發(fā)生。多項實驗證明，IL-6延遲性表達對缺血再灌注后海馬神經(jīng)元有保護作用，抑制IL-1β及TNF-α的合成，對抗谷氨酸引起的細胞損傷。而TNF-α及IL-1β對缺血再灌注后海馬神經(jīng)元有損傷作用，具體機制還需進一步研究。以卒中后炎癥反應(yīng)為基礎(chǔ)，最近Robinson等提出了關(guān)于PSD病因?qū)W的新假說，即細胞因子假說。他們認為，細胞因子與5-HT通過吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO酶)的相互作用可能在PSD中起重要作用:卒中后炎性細胞因子(如IL-1β，TNF-α)增多導(dǎo)致炎癥過程的增強(尤其是邊緣區(qū))和IDO酶的廣泛激活，并繼發(fā)旁邊緣結(jié)構(gòu)如前側(cè)額皮質(zhì)和基底節(jié)的5-HT的耗竭。Tara等在大鼠模型中的研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室灌注IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)可以逆轉(zhuǎn)大鼠的 PSD樣行為，表明PSD可能涉及腦內(nèi)IL-1傳遞的改變。與單純卒中相比，PSD患者可能有致炎性細胞因子水平的進一步升高或高峰持續(xù)時間延長，或抗炎性細胞因子水平的降低或反應(yīng)性升高的延遲，即PSD患者體內(nèi)可能存在著細胞因子網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)的失衡。給予抗炎性細胞因子或抗抑郁治療后，患者可能出現(xiàn)炎性細胞因子水平降低或抗炎性細胞因子水平升高，細胞因子網(wǎng)絡(luò)重新達到穩(wěn)態(tài)，進而減少對海馬的損傷，改善患者抑郁癥狀。

3.2 紅景天是近年來新開發(fā)的高山藥用植物，已有多年臨床應(yīng)用經(jīng)驗，在治療缺血性心臟病及缺血性腦血管病等方面已取得了良好療效

文獻報道，它能在極其惡劣而多變的自然環(huán)境中生長，具有扶正固本、益氣化瘀、抗缺氧、增強免疫功能及雙向調(diào)節(jié)等功效。已證實，紅景天內(nèi)含 Cu-Zn-SOD與Mn-SOD，是重要的超氧自由基清除劑，直接提供并增加SOD水平。它能促使血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生NO，有效抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，改善血小板功能，恢復(fù)纖溶活性，抗體外血栓形成。而其強大的免疫雙向調(diào)節(jié)功能又為其直接降低某些致炎性細胞因子水平，增加抗炎性細胞因子水平，從而穩(wěn)定細胞因子網(wǎng)絡(luò)提供了理論上的可能依據(jù)。

3.3 本實驗研究著眼于對PSD大鼠行為學(xué)的觀察和測試、海馬組織 TNF-α、IL-1β、IL-6含量的測定及海馬CA1區(qū)病理形態(tài)學(xué)的觀察

與單純?nèi)毖M相比，PSD時海馬損傷與細胞因子網(wǎng)絡(luò)改變顯著增加。紅景天各組均可以明顯改善PSD的抑郁行為學(xué)特征及海馬組織神經(jīng)元損傷程度，顯著減低海馬組織的細胞因子 TNF-α、IL-1β水平，而同時提高 IL-6的含量。上述改變尤以中、高劑量紅景天組顯著，可以說明紅景天對PSD具有保護作用。紅景天降低細胞因子水平的作用機制不明，可能與其免疫雙向調(diào)節(jié)功能有關(guān)，即維持體內(nèi)免疫系統(tǒng)處于平衡狀態(tài):既能提高免疫功能，又能防止免疫系統(tǒng)的矯枉過正，從而穩(wěn)定細胞因子網(wǎng)絡(luò)的平衡;既阻止致炎性細胞因子的過度生成，同時又防止抗炎性細胞因子的過度減少。通過穩(wěn)定細胞因子網(wǎng)絡(luò)的平衡，進而減少海馬組織的損傷，達到治療PSD的目的。

［1］江開達.抑郁障礙防治指南［M］.北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2007.1-6.

［2］陳佳俊，石巖殊，韓雪梅，等.線拴法大鼠局灶性腦缺血模型(PMCAO)的實驗研究［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2004，25(10):16-17.

R285.5

B

1006-3250(2010)09-0816-03

遼寧省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目(2008406)

2010-03-08

隋汝波(1971-)，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，碩士研究生導(dǎo)師，從事腦血管病方面的研究。

△通訊作者:隋汝波。Tel:13940653533，E-mail:suirubo 521@yahoo.com.cn。