李 霞，董衛(wèi)紅，韓曼雪，關(guān) 鍵

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥廠，北京 100700)

新清寧片微生物限度檢查方法研究

李 霞，董衛(wèi)紅，韓曼雪，關(guān) 鍵

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥廠，北京 100700)

微生物限度檢查法;驗(yàn)證;新清寧片

新清寧片是由熟大黃粉組成。熟大黃粉具有抑菌作用，按照《中國(guó)藥典》2005年版［1］1部附錄微生物限度檢查方法常規(guī)法檢查，部分細(xì)菌的回收率小于70%，達(dá)不到規(guī)定的要求。本文細(xì)菌檢查法采用培養(yǎng)基稀釋法，霉菌、酵母菌、控制菌檢查法均采用常規(guī)法。

1 材料

1.1 培養(yǎng)基

pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG)，均按照《中國(guó)藥典》2005年版1部附錄要求配制。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、大腸埃希菌［CMCC(B)44102］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉［CMCC(F)98003］均符合《中國(guó)藥典》2005年版1部附錄要求。

1.3 供試品

新清寧片，批號(hào)090202。

2 方法

2.1 菌液的制備

取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃ ～37℃培養(yǎng)18h～24h，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至每ml含菌數(shù)為50cfu～100cfu的菌液備用;取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，23℃ ～28℃培養(yǎng)24h～48h，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至菌液濃度為每1ml含菌數(shù)為50cfu～100cfu。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23℃ ～28℃培養(yǎng)5d～7d，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液3ml～5ml洗下霉菌孢子，吸出孢子液，取1ml孢子液至0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml中，使菌液濃度為50cfu/ml～100cfu/ml。

2.2 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.2.1 供試品溶液的制備 取供試品10 g，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 ml，振搖至供試品分散均勻，制成1∶10的供試液。取1ml置pH 7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液9ml中，即為1∶100的供試液。

2.2.2 微生物限度回收率測(cè)定 菌液組:分別取已制備好的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、黑曲霉、白色念珠菌的菌液 1ml(含50～100cfu)，采用平皿計(jì)數(shù)法，含金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30℃ ～35℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù);白色念珠菌、黑曲霉的實(shí)驗(yàn)平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置23℃～28℃培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)。測(cè)定菌液中每毫升的活菌數(shù)。樣品對(duì)照組:取1∶100供試液1ml，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30℃ ～35℃培養(yǎng)48h，測(cè)定供試品本底的細(xì)菌數(shù);取1∶10供試液1ml，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置23℃ ～28℃培養(yǎng)72h，測(cè)定供試品本底的霉菌和酵母菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)組:取1∶100的供試液1ml和上述細(xì)菌菌液1ml(含50cfu～100cfu實(shí)驗(yàn)菌)，分別注入同一平皿中，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30℃～35℃培養(yǎng)48h，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)和回收率計(jì)算。取1∶10的供試液1ml和上述真菌菌液1ml(含50cfu～100cfu實(shí)驗(yàn)菌)，分別注入同一平皿中，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置23℃ ～28℃培養(yǎng)72h，進(jìn)行霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)和回收率計(jì)算?；厥章?%)=(實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)－樣品本底菌數(shù))/驗(yàn)證加菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。

表1 微生物限度回收率測(cè)定

2.3 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.3.1 大腸埃希菌 接種大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃ ～37℃培養(yǎng)18h～24h，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至每 ml含菌數(shù)為10cfu～100cfu的菌液備用。

供試液的制備:取本品10 ml，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100ml，振搖至供試液分散均勻，制成1∶10的供試液，取1ml置pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9 ml中制成1∶100的供試液，以此類推，至1∶1000的供試液。

驗(yàn)證方法:供試品組:取1∶10的供試液10ml，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中，置35℃ ～37℃培養(yǎng)18h～24h。空白對(duì)照組:取稀釋液10ml，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基 100ml中，置 35℃ ～37℃ 培養(yǎng) 18h～24h。陰性菌對(duì)照組:取 1∶10的供試液10ml，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中，加入金黃色葡萄菌10cfu～100cfu，置35℃ ～37℃培養(yǎng) 18h～24h。陽(yáng)性對(duì)照菌組:取1∶10的供試液10ml，加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中，加入大腸埃希菌10cfu～100cfu，置35℃ ～37℃培養(yǎng)18h～24h。取上述培養(yǎng)物0.2ml，分別加入含5ml的4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG)試管中，置35℃ ～37℃培養(yǎng)5h～24h并觀察結(jié)果。

表2 控制菌檢查結(jié)果

結(jié)果顯示，陽(yáng)性菌生長(zhǎng)良好，表明供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)大腸埃希菌沒(méi)有抑菌作用或是其抑菌作用可以忽略不計(jì)。陰性菌均未檢出，表明該方法的專屬性好，說(shuō)明采用上述方法進(jìn)行本品的大腸埃希菌檢查可行。

2.3.2 大腸菌群 供試品組:取含10ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1∶10的供試液1ml、1∶100 供試液 1ml、1∶1000 供試液 1ml，作為供試品組。驗(yàn)證方法:空白對(duì)照組:取與供試液等量的稀釋劑加入10ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管中作為空白對(duì)照組。陰性菌對(duì)照組:取含10ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入上述1∶10的供試液1ml、1∶100 供試液 1ml、1∶1000 供試液 1ml，分別加入金黃色葡萄球菌10cfu～100cfu作為陰性對(duì)照組。取含10ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入上述 1∶10 的供試液 1ml、1∶100 供試液 1ml、1∶1000供試液1ml，分別加入大腸埃希菌10cfu～100cfu作為陽(yáng)性對(duì)照組。將上述培養(yǎng)基管置35℃ ～37℃培養(yǎng)18h～24h，結(jié)果如下。

表3 各對(duì)照組配置比例配比

結(jié)果顯示，陽(yáng)性菌生長(zhǎng)良好，表明供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)大腸菌群的代表菌大腸埃希菌無(wú)抑菌作用或是其抑菌作用可以忽略不計(jì);陰性菌均未檢出，表明該控制菌檢查方法的專屬性好，說(shuō)明采用此方法進(jìn)行本品的大腸菌群檢查可行。

3 結(jié)論

我們按照《中國(guó)藥典》2005年版1部微生物限度檢查法中常規(guī)法檢驗(yàn)。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、黑曲霉、白色念珠菌實(shí)驗(yàn)菌的回收率均大于70%。按照《中國(guó)藥典》2005年版1部微生物限度檢查法進(jìn)行控制菌的方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)及檢查?？刂凭鷻z查陽(yáng)性菌生長(zhǎng)良好，說(shuō)明本品對(duì)大腸埃希菌、大腸菌群沒(méi)有抑菌作用。陰性菌均未檢出，表明該控制菌檢查方法的專屬性好，可用于控制菌檢查。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典2005年版［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社.

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2010-01-10