劉旭華，朱明慧，郭 凱

（鄭州人民醫(yī)院，河南鄭州 450003）

亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化患者血液環(huán)氧合酶-2水平研究

劉旭華，朱明慧，郭 凱

（鄭州人民醫(yī)院，河南鄭州 450003）

目的：探討亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化（AS）患者血漿中環(huán)氧合酶Ⅱ（COX-2）的活性和單個(gè)核細(xì)胞COX-2mRNA的表達(dá)水平。方法：分別應(yīng)用酶聯(lián)免疫法和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)100例亞臨床AS患者和40例健康對(duì)照血漿COX-2活性與單個(gè)核細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果：亞臨床AS組COX-2血漿活性水平[(10.84±3.11)U/L]明顯高于正常對(duì)照組[(6.97±1.25)U/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RT-PCR半定量分析發(fā)現(xiàn)亞臨床AS組血液中單個(gè)核細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)的平均吸光度（0.244 8±0.090 3）較正常對(duì)照組（0.005 8±0.002 7）顯著升高(P<0.01)。結(jié)論：COX-2血漿活性水平和COX-2mRNA的表達(dá)水平與亞臨床AS有明顯相關(guān)性，檢測(cè)血漿COX-2活性和COX-2mRNA的表達(dá)可作為亞臨床AS監(jiān)測(cè)的參考指標(biāo)。

動(dòng)脈粥樣硬化；環(huán)氧合酶Ⅱ；亞臨床

亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是指有AS的易患因素,而無(wú)AS臨床表現(xiàn)的疾病發(fā)展階段。資料顯示[1]：該階段動(dòng)脈內(nèi)存在活躍的低度慢性炎癥，動(dòng)脈內(nèi)的輕微炎癥是一個(gè)引發(fā)刺激、損傷、愈合的反復(fù)過(guò)程，最終形成斑塊，其結(jié)果導(dǎo)致動(dòng)脈狹窄或粥樣斑塊。環(huán)氧合酶Ⅱ(COX-2)是動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中重要的炎癥介質(zhì)之一。RT-PCR分析表明COX-2在血管平滑肌、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞均有表達(dá)，COX-2的過(guò)度表達(dá)可造成血管壁的炎癥、斑塊的不穩(wěn)定和內(nèi)膜增生。許多病理研究表明，COX-2直接參與了AS病理發(fā)生及斑快炎性反應(yīng)的調(diào)控過(guò)程。筆者采用外周血測(cè)定COX-2水平和COX-2mRNA的表達(dá)，方便簡(jiǎn)捷,能為臨床診治提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 亞臨床AS組 選取100例患者，其中，男62例，女38例，年齡27～82歲，平均（54.0±12.8）歲。其均為有高血壓、高血脂、長(zhǎng)期抽煙史、糖尿病或肥胖等至少一項(xiàng)以上AS的易患因素但無(wú)癥狀的亞臨床AS疾病患者，或有酗酒史、心理或社會(huì)壓力大者，且超聲檢測(cè)頸動(dòng)脈 IMT>1.0 mm或發(fā)現(xiàn)斑塊且無(wú)心腦腎及外周血管病變的臨床表現(xiàn)[2]。

1.1.2 健康對(duì)照組 正常對(duì)照組來(lái)自體檢健康人群，共40例，其中，男 25 例，女 15 例，年齡 32～81 歲，平均（54.5±12.3）歲，無(wú)高血壓、糖尿病及心、肺、肝、腎、腦和血液系統(tǒng)的疾病，無(wú)近期外傷手術(shù)史。全部入選對(duì)象均排除有急慢性感染、腫瘤、免疫性及變態(tài)反應(yīng)性疾病。

1.1.3 標(biāo)本采集 收集靜脈血5 ml EDTA抗凝，3 000 r/min離心5 min，分離血漿；淋巴細(xì)胞分離液1 500 r/min離心15 min分離單個(gè)核細(xì)胞。分別于-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

COX-2活性試劑盒由西班牙Cayma公司提供。ELX 800NB酶標(biāo)儀由美國(guó)BIO-TEK公司生產(chǎn)。核酸分析儀DU800由美國(guó)貝克曼公司生產(chǎn)，核酸擴(kuò)增儀PE9700由美國(guó)ABI公司生產(chǎn)，Trizol試劑由美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)，淋巴細(xì)胞分離液由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所生產(chǎn)，Oligo(dt)20引物及逆轉(zhuǎn)錄酶均為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品，GELDOC-OTTS凝膠分析系統(tǒng)由美國(guó)UVP公司生產(chǎn)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血漿活性檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)檢測(cè)COX-2的活性。試劑盒平衡至室溫，所有標(biāo)本復(fù)溶后嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)在規(guī)定時(shí)間完成操作，試驗(yàn)終止后酶標(biāo)儀于590 nm處測(cè)得所有標(biāo)本吸光度，根據(jù)試劑盒提供公式轉(zhuǎn)換成COX-2活性。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中COX-2mRNA表達(dá)Trizol試劑抽提提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA，用核酸分析儀DU800檢測(cè)RNA濃度和純度。取2 μg總RNA，加入Oligo(dt)20引物及逆轉(zhuǎn)錄酶在25 μl體積下，行以下熱處理：30℃，10 min；42℃，20 min；99℃，5 min；4℃，5 min；最后瞬間離心。完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。COX-2引物序列為:上游 5′-TGAAACCCACTCCAAACACA-3′，下游 5′-TGGAACAACTGCTCATCACC-3；β-actin 引物序列為：上游 5′-CGT GACATTAAGGAGAAGCTG-3′，下 游 5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3′，均由上海生物工程公司合成。反應(yīng)條件 COX-2 為：94℃，30 s；55℃，1 min；72℃，2 min；72℃，10 min，35 個(gè)循環(huán)；β-actin 為：94℃，1 min；56℃，1 min；72℃，1 min；72℃，7 min，35個(gè)循環(huán)。COX-2、β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為728 bp和375 bp。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，利用GELDOC-OTTS系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行掃描，以COX-2/β-actin的吸光度(A值)作為COX-2mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血漿COX-2活性和血液中單個(gè)核細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)

見(jiàn)表1。

表1 COX-2在亞臨床AS組與對(duì)照組中比較(±s)

表1 COX-2在亞臨床AS組與對(duì)照組中比較(±s)

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

組別 例數(shù)（n） COX-2(U/L) COX-2mRNA(A值)亞臨床AS組正常對(duì)照組100 40 10.84±3.11*6.97±1.25 0.244 8±0.090 3**0.005 8±0.002 7

2.2 血漿COX-2活性和血液中單個(gè)核細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)相關(guān)性分析

直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)血漿COX-2活性和血液中單個(gè)核細(xì)胞COX-2mRNA 表達(dá)之間呈正相關(guān)（r=0.791，P<0.05）。

3 討論

COX-2具有“炎癥應(yīng)答基因”的特點(diǎn)，能引起炎癥部位的PGI2、PGE2和PGE1等的含量增加，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重組織損傷。而COX-2誘導(dǎo)和表達(dá)增加又引起炎癥反應(yīng)的放大和增強(qiáng):COX-2可誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)因子合成，使新生血管增多而促進(jìn)了粥樣斑塊病變的發(fā)生和發(fā)展[3]。Belton等[4]對(duì)42名進(jìn)行外科血管重建手術(shù)的AS患者進(jìn)行研究，通過(guò)免疫組化及RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)COX-2在AS區(qū)域表達(dá)。不僅如此，涉及AS形成過(guò)程的促炎癥反應(yīng)介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)-1、干擾素(IFN)-α等炎癥因子、缺氧以及切應(yīng)力刺激等，均可誘導(dǎo)COX-2表達(dá)[5]。文獻(xiàn)有關(guān)血漿COX-2活性檢測(cè)和血液中單個(gè)核細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)水平的研究報(bào)道并不多，本研究發(fā)現(xiàn)：在亞臨床AS階段，血液中即可檢測(cè)到低水平的COX-2表達(dá)。

亞臨床冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是指有動(dòng)脈粥樣硬化的易患因素如年齡、性別、吸煙、肥胖、高血壓、高血脂、糖尿病以及胰島素抵抗等，而無(wú)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的臨床表現(xiàn)。動(dòng)脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，除了傳統(tǒng)易患因素，近年一些非傳統(tǒng)易患因素越來(lái)越引起人們的重視，如Hcy、炎癥、hs-CRP、氧化修飾脂蛋白等。已有證據(jù)表明[6]：COX作為前列腺素(PG)合成過(guò)程中的一個(gè)限速酶，在炎性反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用。當(dāng)COX-2大量被誘導(dǎo)生成和表達(dá)時(shí)，炎性反應(yīng)被放大和增強(qiáng)。COX-2還可誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)因子合成，使新生血管增多，促進(jìn)粥樣斑塊病變的發(fā)生和發(fā)展[7]。因此降低細(xì)胞中COX-2表達(dá)是治療動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。選擇性COX-2抑制劑可以抑制血管炎癥，因而可以減少單核細(xì)胞浸潤(rùn)，延緩AS進(jìn)程，增加斑塊穩(wěn)定性從而減少粥樣硬化血栓事件[8]。

表1顯示亞臨床AS組血漿COX-2活性顯著高于對(duì)照組，血液中單個(gè)核細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)亞臨床AS組非常顯著高于對(duì)照組。說(shuō)明在亞臨床AS階段，局部炎癥部位有COX-2表達(dá)增高而釋放入血。兩種方法之間顯著相關(guān)（r=0.791，P<0.05）。相對(duì)于 COX-2mRNA 檢測(cè)，血漿中 COX-2檢測(cè)較為簡(jiǎn)單，不需要特殊設(shè)備，可方便應(yīng)用于高危人群監(jiān)測(cè)，以便臨床進(jìn)行早期干預(yù)，從而可能有助于降低心血管意外發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)[9]。

[1]Keichl S,Egger G,Mayr M,et al.Chronic infections and the risk of carotid atherosclerosis:Prospective results from a large population study[J].Circulation,2001,103:1064-1071.

[2]Riley WA.Cardioyascular risk assessment in individual patients from carotid intimal-medical thickness measurements[J].Curr Atheroscler Rep,2004,6(3):225-231.

[3]LintonMF,Fazio S.Cyclooxygenase-2 and inflammation in atherosclerosis[J].CurrOpin Pharmaco,2004,4:116-123.

[4]Belton O,Byrne D,Kearney D,et al.Cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2-dependentprostacyclin formation in patients with atherosclerosis[J].Circulation,2000,102(8):840-845.

[5]Massy ZA,Swan SK.Cyclooxygenase-2 and atherosclerosis:friend or foe[J].Nephrol Dial Transplant,2001,16(12):2286-2289.

[6]Cipollone F,Rocca B,Patrono C.Cyclooxygenase-2 expression and inhibi tion in atherothrombosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Bio,2004,24(2):246-255.

[7]Mac Rac F,Sergio F.Cyclooxygenase-2 and atherosclerosis[J].CurrOpin Lipido,2002,13(5):497-504.

[8]PittB,Pepine C,Willerson JT.Cyclooxygenase-2 inhibition and cardiovascular events[J].Circulation,2002,106(2):167-169.

[9]Grosser T,Fries S,Fitzgerald GA.J Biological basis for The cardiovascular conseguences of COX-2 inhibition:Therapeutic challenges and opportunities[J].Clin Invest,2006,116(1):4-5.

R115

B

1674-4721（2010）09（b）-074-02

2010-08-09）