盧慶紅,涂 瓊

(江西省兒童醫(yī)院藥劑科,南昌330006)

抗性早熟合劑為醫(yī)院驗(yàn)方,由淮山、茯苓、生地、知母、赤芍、玄參、夏枯草8味中藥組成。經(jīng)多年的臨床實(shí)踐證實(shí),該藥具有清熱燥濕、利水補(bǔ)腎之功效,臨床上主要用于兒童性早熟的治療。為了有效控制該制劑的質(zhì)量,采用薄層色譜(T LC)法對(duì)抗性早熟合劑方中夏枯草進(jìn)行了定性鑒別,用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法同時(shí)測(cè)定了抗性早熟合劑方中所含芍藥苷的含量。

1 主要試劑、試藥與儀器

夏枯草對(duì)照藥材、芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):0773-9921),五氧化二磷(張家港東昌化工廠,批號(hào):20031011)為化學(xué)純,甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸為色譜純,其余試劑均為分析純,水為重蒸餾水,抗性早熟合劑(江西省兒童醫(yī)院制劑室自制,批號(hào):050314、050418、050705)。硅膠 G 薄層板(江西省兒童醫(yī)院臨床藥學(xué)室自制,規(guī)格:5 cm×20 cm),島津10Avp高效液相色譜儀,CQ-250超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司),TG 3288 1/10 000電子分析天平(上海天平儀器廠),TGL-16GB小型通用離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),ZFC型三用紫外分析儀、WFH-203三用紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司),H.H.S21-4B電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 夏枯草的鑒別

1) 供試品溶液的制備:取抗性早熟合劑50 mL,加氯仿50 mL回流萃取1 h,重復(fù)2次,合并氯仿液,蒸干,殘?jiān)右掖? mL使溶解,作為供試品溶液。

2) 對(duì)照藥材溶液的制備:另取夏枯草對(duì)照藥材粉末2.0 g,水煎液按供試品溶液的制備方法制成藥材對(duì)照液。

3) 陰性對(duì)照溶液的制備:取缺夏枯草的樣品,按供試品溶液的制備方法制成空白溶液。

4) TLC及結(jié)果:按T LC法(中國(guó)藥典 2005年版一部附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)[1],吸取上述3種溶液各10 μ L,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚-二氯甲烷-冰乙酸(10∶15∶1)為展開(kāi)劑,展開(kāi)、取出、晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液[1],105℃加熱約10 min。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同斑點(diǎn),陰性樣品無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 夏枯草的 TLC鑒別

2.2 芍藥苷的RP-HPLC測(cè)定

1) 色譜條件:C18(150 mm×4.6 mm,5 μ m);流動(dòng)相:乙腈-3%冰醋酸(15 ∶85);流速:1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm,柱溫:30 ℃;理論塔板數(shù)＞1 500,分離度＞1.5。

2) 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取經(jīng)60℃五氧化二磷真空減壓干燥36 h的芍藥苷對(duì)照品6.70、9.80 mg,分別置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,分別得濃度為(Ⅰ)670.0 μ g· mL-1、(Ⅱ)980.0 μ g·mL-1的對(duì)照品溶液,放置低溫避光處保存,備用。

3) 供試品溶液的制備:量取抗性早熟合劑80 mL,置于蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,殘?jiān)?%甲酸甲醇溶液溶解,過(guò)濾,濾液置于10 mL容量瓶中,定容至刻度,搖勻,放置 24 h[2]。然后,超聲提取30 min,放置至室溫后再加5%甲酸甲醇溶液[1]補(bǔ)充減失的體積,搖勻,精密量取5 mL置于具塞玻璃離心管中,以 4 000 r·min-1離心 10 min,取上清液,用0.22 μ m微孔濾膜濾過(guò),作為供試品溶液。

4) 空白試驗(yàn):按照上述色譜條件,精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液(陰性樣品溶液的制備:按照本品的處方制法,制備缺少赤芍的陰性樣品,按供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液)各20 μ L,分別用自動(dòng)進(jìn)樣器注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,結(jié)果顯示,供試品色譜中在于對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,有相同保留時(shí)間的色譜峰,而陰性樣品在此保留時(shí)間無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 芍藥苷、供試品、陰性樣品色譜圖

5) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:按照濃度梯度,精密量取一定體積的芍藥苷對(duì)照品溶液(Ⅱ),加甲醇稀釋,搖勻,得濃度分別為 49.00、61.25、98.00、164.15、245.00、367.50 、490.00 μ g·mL-1的溶液,用0.22 μ m 微孔濾膜濾過(guò),按上述色譜條件,分別吸取 20 μ L注入高效液相色譜儀,記錄色譜峰,測(cè)定峰面積。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),濃度(X)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得芍藥苷的回歸方程為Y=9.22X-44.03(r=0.999 8),結(jié)果表明,芍藥苷檢測(cè)濃度在 49.0～490.0 μ g·mL-1范圍內(nèi),與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

6) 精密度試驗(yàn):精密吸取同一芍藥對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,其峰面積分別為1570.8、1 590.3、1 584.4、1 613.8、1 575.5、1 578.3,平均值為1 585.5,RSD=0.72%。

7) 穩(wěn)定性試驗(yàn):取抗性早熟合劑,照樣品處理方法進(jìn)行處理后,于常溫下放置 0、1、2、3、6、12 h,測(cè)定芍藥苷峰面積,RSD=0.93%。

8) 重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一批樣品,按芍藥苷供試品溶液制備方法制成6份供試品溶液,平行測(cè)定。結(jié)果:藥苷的含量為34 μ g·mL-1,RSD=2.75%。

9) 加樣回收率試驗(yàn):分別精密量取同一批次且已測(cè)定芍藥苷含量的抗性早熟合劑80 mL,共9份,分別精密加入670.0 μ g·mL-1的芍藥苷對(duì)照品溶液 0.5、1.0、2.0 mL,充分混勻,按芍藥苷供試品溶液測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定,平均加樣回收率為98.5%,RSD=2.24%。

10) 樣品含量測(cè)定:取3批抗性早熟合劑各80 mL,分別按上述提取方法提取后,在色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,以外標(biāo)法計(jì)算芍藥苷含量,見(jiàn)表1。

表1 不同批次抗性早熟合劑中芍藥苷含量的測(cè)定結(jié)果

3 討論

抗性早熟合劑由多味中藥組成,組分復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)采取較為簡(jiǎn)便、易行的TCL法,采取選用對(duì)照,藥材隨行對(duì)照,并采用陰性樣品進(jìn)行對(duì)比,斑點(diǎn)分離清晰,重現(xiàn)性好,方法無(wú)干擾。

在方法選擇上,采用紫外分光光度法進(jìn)行芍藥苷含量測(cè)定[3],但專屬性不強(qiáng),對(duì)于復(fù)雜成分的制劑不適用。在流動(dòng)相的選擇上,于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,用不同的流動(dòng)相:甲醇-1%冰醋酸(30∶70)、乙腈-1%冰醋酸(40∶60)、甲醇-2%冰醋酸(32∶68)、乙腈-3%冰醋酸(15∶85)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),以乙腈-3%冰醋酸(15∶85)最為合適。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:109.

[2]黃欣,蘇樂(lè)群,韓玉東,等.反相高效液相色譜法測(cè)定少腹逐淤微粉顆粒中芍藥苷的含量[J].中國(guó)藥房,2005,16(6):457.

[3]白雁,李喜鳳.活血逐瘀顆粒劑中芍藥甙的含量測(cè)定[J].光譜學(xué)與光譜分析,1998,18(5):637-639.