任春云，金明超，包丹妮，郭希超

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州 310003)

網(wǎng)織血小板(reticulated platelet,RP)或未成熟血小板于1969年由Ingram和Coopersmith首次發(fā)現(xiàn)，其胞質(zhì)中含有殘留核糖核酸(RNA)成分，被認(rèn)為是一種新生的血小板,能較敏感地反映巨核細胞的血小板生成能力[1]，與成熟血小板相比，具有平均體積大和質(zhì)量重的特點，應(yīng)用于血小板減少、血小板增多癥的診斷和骨髓造血功能恢復(fù)的預(yù)測[2]。九十年代開始使用流式細胞儀檢測網(wǎng)織血小板，但因其操作復(fù)雜，缺乏質(zhì)控，重復(fù)性差，價格貴等原因未能廣泛采用。目前Sysmex XE-2100血細胞分析儀通過軟件升級即可檢測網(wǎng)織血小板參數(shù)—未成熟血小板比率(IPF immature platelet fraction)，根據(jù)美國病理家協(xié)會(CAP)對實驗室質(zhì)量管理和認(rèn)可的要求[3]，實驗室必須對新檢測系統(tǒng)進行方法學(xué)評價并按就診人群建立各自的本實驗室參考區(qū)間，因此我們對Sysmex XE-2100檢測網(wǎng)織血小板參數(shù)IPF檢測系統(tǒng)進行性能評價試驗并建立了本實驗室的參考區(qū)間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 選取患者IPF高、中、低值做相關(guān)性能評價，批間精密度采用同一批次質(zhì)控；選取248例來自我院2009年11月～12月的健康體檢者，排除其他內(nèi)外科疾病，血液生化及影像資料無明顯異常者，用于確定參考區(qū)間，其中男性122例，女性126例，年齡17～81歲，平均37歲。

1.1.2 標(biāo)本采集 采用EDTA-K2抗凝管空腹采靜脈血2ml，混勻后于2h內(nèi)檢測。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器及試劑 Sysmex XE-2100血細胞分析儀并且系統(tǒng)軟件升級版，聚次甲基染料、氨丁三醇緩沖液、鞘液試劑、質(zhì)控等,均為該公司原裝配套試劑。

1.2.2 校準(zhǔn)及質(zhì)控 對Sysmex XE-2100血液分析儀用其配套校準(zhǔn)品按校準(zhǔn)程序校準(zhǔn)，校準(zhǔn)測定結(jié)果和靶值比較，根據(jù)需要對儀器參數(shù)進行修正，使結(jié)果和靶值偏差在可允許范圍內(nèi)，表明校準(zhǔn)合格。儀器每日測試前均做本底檢測和室內(nèi)質(zhì)控，檢測指標(biāo)在質(zhì)控通過后進行。

1.3 檢測方法

1.3.1 樣本檢測 采用CBC+RET通道自動計數(shù),經(jīng)稀釋并染色后檢測分析IPF。

1.3.2 精密度試驗 選取IPF中值 (10.2±0.5×109/L)、低值(3.1±0.3×109/L)兩種不同 IPF 水平的標(biāo)本各10份,每份連續(xù)檢測11次，去掉第一次結(jié)果，取后10次結(jié)果評價中、低組標(biāo)本批內(nèi)CV；取三種水平的質(zhì)控，連續(xù)檢測20天，評價批間CV。

1.3.3 攜帶污染率 取IPF絕對值高值 (21.2×109/L)標(biāo)本、低值(4.0×109/L)標(biāo)本各一份，連續(xù)檢測 3次高值標(biāo)本 (H1、H2、H3)，再連續(xù)檢測3次低值標(biāo)本(L1、L2、L3)，其攜帶污染率=(L1-L3)/(H3-L3)×100%。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗 選取10名健康志愿者，同時采集2份標(biāo)本，室溫保存(22℃左右)，分別用于：①短期穩(wěn)定性：在 0、1、2 、4、8和 12 h后上機檢測。 ②長期穩(wěn)定性：在 0、12、24、36h 后檢測。

1.3.5 分析測量范圍(AMR)評價 取IPF絕對值高值 (IPF%=14.0%、IPF#=50.4×109/L)和低值 (IPF%=7.1%、IPF#=0.4×109/L)，分別以 4:1、3:2、1:1、1:2、1:3、1:10比例混合，共8個水平標(biāo)本，標(biāo)本中IPF絕對值按照比例計算，每一水平檢測2次，計算，以期望值和測定值作回歸分析。

1.4 建立參考區(qū)間

1.4.1 取上述248例標(biāo)本上述方法檢測分析結(jié)果。

1.4.2 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0分析軟件，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，男女分組采用Z檢驗，正常參考區(qū)間采用95%可信區(qū)間表示，數(shù)據(jù)以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗(見表1、表2)。

表1 批內(nèi)精密度

表2 批間精密度

2.2 攜帶污染率 IPF絕對值為：0.98%；IPF%為：0.36%。

2.3 穩(wěn)定性試驗 標(biāo)本在8h內(nèi)檢測較穩(wěn)定(CV均<6%),超過12h穩(wěn)定性的變異系數(shù)CV偏高，提示檢測網(wǎng)織血小板應(yīng)在8h內(nèi)完成結(jié)果穩(wěn)定 (：P[IPF%]=0.12，P[IPF#]=0.25)。 (見圖 1、表 3)。

2.4 分析測量范圍 利用SPSS相關(guān)和回歸分析，其相關(guān)系數(shù)γ=0.9975(P<0.01)，回歸方程y=0.9998x+1.3028(圖 2)。 按 α=1.00±0.05，γ≥0.97 為標(biāo)準(zhǔn)，AMR評價符合要求，本檢測系統(tǒng)IPF的AMR為：50.4～0.4×109/L。

圖1 均值隨時間變化圖

表3 IPF的穩(wěn)定性

圖2 IPF AMR

2.5 參考區(qū)間建立 248例健康體檢者的血液標(biāo)本IPF數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，采用第2.5～97.5百分位數(shù)作為參考區(qū)間。男女分組采用Z檢驗[4]，IPF%:Z=4.16>Z*=3.05；IPF 絕對值：Z=3.95>Z*=3.05 男女組間存在差異，參考區(qū)間需要男女分組(見表4)。

表4 IPF的參考區(qū)間

3 討論

根據(jù)美國病理學(xué)家協(xié)會(CAP)對實驗室質(zhì)量的管理要求，對新檢測系統(tǒng)必須驗證其相關(guān)分析性能。本實驗結(jié)果顯示，IPF%批內(nèi)CV分別為4.9%、6.2%，批間CV分別為3.3%、3.9%、3.6%，IPF絕對值批內(nèi)CV分別為 5.3%、8.0%，批間 CV分別為 3.4%、4.3%、4.8%，攜帶污染率分別為0.36%、0.98%，穩(wěn)定性試驗中8h內(nèi)變異系數(shù)CV分別為5.4%、5.6%，36h CV分別為16.2%、20.4%，表明檢(下轉(zhuǎn)第462頁)Dsg3抗體在天皰瘡患者和類天皰瘡患者中的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

天皰瘡是自身免疫性疾病，其病理基礎(chǔ)是抗體沉積在表皮內(nèi)棘層細胞間，從而引起棘層細胞松解，形成表皮內(nèi)水皰，在臨床表現(xiàn)上與類天皰瘡不易區(qū)分。實驗室診斷方法有組織病理、直接免疫熒光、間接免疫熒光檢測自身抗體。在病損部位取活體組織用直接免疫熒光法檢測抗體，能看見IgG和C3沉積在棘層細胞間，而類天皰瘡病人抗體沉積在表皮基底膜處，可資鑒別，該法診斷清楚，結(jié)果可靠，且陽性率高[1]。天皰瘡患者的血清中有抗表皮物質(zhì)間的抗體，一般使用猴食道或包皮為底物，用間接免疫熒光法可以檢出，但其陽性率在兩種底物上會有所不同?，F(xiàn)代分子學(xué)已知尋常型天皰瘡(PV)和落葉型天皰瘡(PF)的抗原為來自表皮的鈣黏素超家族的糖蛋白，分別是橋粒芯糖蛋白3(Dsg3)、橋粒芯糖蛋白1(Dsg1)。我們用ELISA法檢測抗Dsg1抗體和抗Dsg3抗體，結(jié)果顯示，在天皰瘡病人血清中有較高的陽性率，而在類天皰瘡病人的血清中未發(fā)現(xiàn)陽性，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究中抗橋粒芯蛋白抗體的總陽性率高于文獻報道[2]，這可能與我們所選病人多數(shù)為活動期有關(guān)，因為據(jù)文獻報道天皰瘡患者病情與抗橋粒芯糖蛋白抗體水平有相關(guān)性[3]。綜上所述，直接免疫熒光法是一種十分可靠的診斷方法，但該法操作較復(fù)雜，結(jié)果判斷要求有一定的病理學(xué)基礎(chǔ)，而且取材不便，對于患者會造成損傷。間接免疫熒光檢測自身抗體受底物影響。ELISA法操作簡便，重復(fù)性好，待檢標(biāo)本只需10μl血清，陽性率較高。因此，ELISA法檢測抗Dsg1抗體和抗Dsg3抗體在天皰瘡的診斷和病情監(jiān)測中有重要價值。

致謝：南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 王小中 博士 審閱。

[1]趙永鏗,羅瑞固,林頁新,等.天皰瘡患者不同部位皮膚及不同稀釋度熒光抗體直接免疫熒光檢查的對照研究 [J].中華皮膚科雜志,1989,23(4):228-229.

[2]張蜀瀾,佟大偉,李永哲,等.天皰瘡相關(guān)自身抗體的檢測及其臨床意義[J].檢驗醫(yī)學(xué),2007,22(5):551-553.

[3]閆 言,王寶璽,渠 濤,等.天皰瘡患者病情與抗橋粒芯糖蛋白抗體水平的相關(guān)性研究[J].臨床皮膚科雜志,2003,32(9):512-514.