楊月仙, 張茂林, 劉 波

腦梗死(CI)是中老年人常見的多發(fā)病,其病殘率與死亡率很高。腦梗死的發(fā)病是由環(huán)境和遺傳因素共同起著作用。研究[1～3]發(fā)現(xiàn),單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)基因調(diào)控區(qū)序列多態(tài)性位點-2518G/A可能與 MCP-1轉錄活性有關,而且與動脈粥樣硬化、冠心病等的發(fā)病有關。目前文獻研究較多的是糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、冠心病與基因多態(tài)的關系。但它和缺血性腦血管病的關系的臨床研究較少,特別是和腦梗死病情輕重的關系尚未見臨床研究報道。本研究應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性方法檢測腦梗死患者和健康人的MCP-1基因-2518G/A多態(tài)性,分析并探討急性腦梗死與 MCP-1多態(tài)性之間的關系,

1 資料與方法

1.1 臨床資料 (1)腦梗死組:2009年 6月 ～2010年 1月包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性腦梗死患者 148例,病程 ＜3d;均符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的診斷標準[4],并經(jīng)頭部 CT/MRI證實。排除標準:合并腦出血、惡性腫瘤患者;近 1個月內(nèi)有感染史、近 3個月內(nèi)有心肌梗死或心絞痛病史,合并慢性炎性反應(關節(jié)炎、血管炎、膽囊炎)患者;風濕病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等免疫性疾病患者;肝腎功能不全患者。其中男 82例,女 66例,年齡 42～75(60.97 ±7.7)歲。(2)正常對照組:選取 130名在包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院體檢中心進行體檢的年齡、性別相匹配的無腦梗死的體檢者。排除標準同腦梗死組。男 60例,女70例,年齡 39～72(59.3±7.42)歲。

1.2 檢測方法

1.2.1 基因組 DNA樣品制備 抽取入組者外周靜脈血 5ml枸櫞酸鈉抗凝,-20℃保存至提取基因組 DNA,應用常規(guī)苯酚-氯仿方法抽提基因組DNA。

1.2.2 MCP-1-2518G/A基因多態(tài)性分析 引物序列[1]由大連寶生物有限公司合成,具體序列如下:上游引物 5'-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3',下游引物 5'-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3'。PCR反應體系采用試劑盒配制法,具體如下:10×buffer 50μl,dNTP 10μl(濃度為 10μmol/l),正負引物各4μl(1 OD溶于 200μl H2O),H2O 332μl(合計400μl),混勻后分管,每管 10μl,加液體石蠟12.5μl,Taq酶 0.6μl(2U/μl),每管加基因組 DNA 2μl。反應條件:93.5℃預變性 3min,94℃變性 35s,55℃退火 45s,72℃延伸 5min,共 30循環(huán),繼后 72℃終末延伸 5min。PCR擴增目的條帶為 930bp。取 PCR擴增產(chǎn)物 10μl加限制性內(nèi)切酶 PvuII 1μl及相應緩沖液,用蒸餾水補齊至 20μl,混均后離心 30s。放入37℃水浴箱中孵育 12h使樣品完全酶切。2%瓊脂糖凝膠電泳,以 100bp Marker為相對分子質(zhì)量標記,于紫外燈下觀察結果并拍照記錄(見圖1)。其中GG基因型可見兩條電泳帶為 708bp、222bp;GA基因型電泳帶為 930bp、708bp、222bp;AA基因型電泳帶為 930bp。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS13.0軟件包進行數(shù)據(jù)處理。采用直接計數(shù)法計算 MCP-1基因-2518G/A等位基因頻率。由于每個患者 MCP-1基因-2518G/A位點均有兩個等位基因,故等位基因頻率 =等位基因陽性數(shù) /總基因數(shù)(患者數(shù) χ2)。計數(shù)資料以率(%)表示,采用 χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 腦梗死與對照組基因型及等位基因頻率分布 腦梗死組患者 148例,其中 GG基因型 52例,GA基因型為 68例,AA基因型 28例。腦梗死組MCP-1基因-2518G/A基因型 GG、G等位基因頻率均高于對照組(P＜0.05)(見表1)。

2.2 病情與 MCP-1-2518G/A基因型及等位基因頻率發(fā)布 病情重度的患者 MCP-1基因-2518G/A,GG基因型及 G等位基因頻率均明顯高于病情輕度的患者,P＜0.05。病情輕度與中度及中度與重度之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(見表2)。

表1 MCP-1基因-2518G/A基因型分布及等位基因頻率(例,%)

表2 病情與MCP-1基因多態(tài)性分布及等位基因頻率的關系(例,%)

圖1 MCP-1基因-2518位點 PVuII酶切圖(MMarker;1 GG;6 AA;2,3,4,5均為 GA)

3 討 論

近年的研究表明多種免疫細胞及細胞因子參與了腦梗死的發(fā)生、發(fā)展及修復過程。MCP-1是趨化因子 CC類亞家族成員之一,以簇聚方式定位于人17號染色體和小鼠 11號染色體,對白細胞、T淋巴細胞、嗜堿性細胞、自然殺傷細胞和造血祖細胞均有趨化作用。正常腦組織不表達 MCP-1,當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損害刺激(包括感染、創(chuàng)傷、卒中以及免疫調(diào)節(jié)障礙等)時,小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化,前者在 MCP-1作用下迅速增殖并向受損部位遷移,吞噬壞死組織而變?yōu)橥淌杉毎CP-1基因表達主要在轉錄水平的 2個區(qū)域內(nèi)受到調(diào)控:(1)近端調(diào)控區(qū):主要由血小板源性生長因子 (platelet-derived growth factor,PDGF)和干擾素(interferon,IFN)-γ誘導表達;(2)遠端調(diào)控區(qū):可與核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)結合,調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子 (tumo rnecrosis factor,TNF)誘導的 MCP-1表達[5]。1999年 Rovin[1]等通過直接測序 PCR擴增的基因組 DNA發(fā)現(xiàn)在 MCP-1的遠端調(diào)控區(qū)有 2個新的多態(tài)性位點。這個雙基因多態(tài)性在重要的轉錄起始位點相關基因-2518(G/A)和-2076(A/T)位點上。在-2076位點的基因多態(tài)性不影響 MCP-1的轉錄。同時發(fā)現(xiàn)MCP-1基因啟動子區(qū)第 2518位核苷酸存在 A-G堿基突變,存在 3種基因型:野生型純合子 AA、雜合子AG和突變型純合子 GG,構成了 MCP-1基因啟動子區(qū)-2518A/G單核苷酸多態(tài)性。在-2518 G位點的雜合子或純合子的個體與在-2518 A位點的純合子的個體相比較,用 IL-1β處理外周血單核細胞,前者產(chǎn)生更多的 MCP-1;說明 MCP-1的遠端調(diào)控區(qū)的多態(tài)性通過炎癥刺激的應答而影響 MCP-1表達。

既往亦有研究[1,6]報道,冠心病患者具有較高的G等位基因攜帶頻率。我們推測,MCP-1基因-2518G/A多態(tài)性與動脈粥樣硬化、冠心病、腦梗死等這些缺血性血管疾病的發(fā)病存在一定相關性。本研究結果顯示:腦梗死組 MCP-1基因-2518G/A位點 G等位基因頻率明顯高于對照組(χ2=5.636,P=0.018)。提示 G等位基因可能是腦梗死發(fā)病的遺傳易感基因。

文獻報道[7],急性腦梗死患者中、重度組的MCP-1水平明顯高于輕度組,MCP-1的水平與腦梗死的嚴重程度成正相關。本研究中,腦梗死患者輕、中、重之間 MCP-1基因-2518G/A位點 G等位基因頻率存在差異(χ2=7.062,P=0.029)。重度組的MCP-1基因-2518G/A位點 G等位基因頻率明顯高于輕度組(χ2=6.059,P=0.014),差異顯著。推測MCP-1基因-2518G/A多態(tài)是通過調(diào)節(jié) MCP-1基因的轉錄、翻譯表達,進而影響腦梗死的發(fā)生、發(fā)展;MCP-1基因-2518G/G基因型可上調(diào) MCP-1的表達,增加單核細胞的聚集,從而增加動脈粥樣硬化損害及腦梗死發(fā)病的危險性。

MCP-1作為一種主要的單核細胞趨化因子,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起雙重作用。一方面,MCP-可誘導單核巨噬細胞到達受損部位參與組織修復,是機體防御的重要組成部分;另一方面,組織局部產(chǎn)生的大量 MCP-1又可引起過度的炎癥反應,從而加重組織損傷。隨著對 MCP-1的分子結構、生物學功能、基因定位和調(diào)節(jié)信號轉導機制的進一步認識,以及它對其他細胞因子和炎癥細胞調(diào)控的深入研究,探索干預某些環(huán)節(jié)的可能性,研制相應抗體和藥物,將有可能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療和干預提供一條新的思路。

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