李 華, 方伯言, 高 峰

阿爾茨海默病 (Alzheimer's disease,AD)是老年人最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,神經(jīng)元缺失為其3大病理特征之一,其病因及其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。研究[1]證實自發(fā)的中樞神經(jīng)細(xì)胞死亡與不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞損傷有關(guān)。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為與 AD神經(jīng)元退行性變過程中幾個階段有關(guān),所以有些研究者[2,3]認(rèn)為 AD中神經(jīng)細(xì)胞死亡是由凋亡介導(dǎo)的。細(xì)胞內(nèi)酸化是細(xì)胞凋亡過程中的一種細(xì)胞內(nèi)信號變化,通過影響核酸內(nèi)切酶的活性、影響原癌基因在凋亡過程中的作用、影響細(xì)胞凋亡發(fā)生率等途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實驗利用體外培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞,應(yīng)用 Aβ25-35誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元凋亡,檢測細(xì)胞內(nèi) pH值變化及膜上 Na+/H+交換蛋白 1(NHE1)、神經(jīng)元凋亡的特異標(biāo)志蛋白鈣調(diào)蛋白(CaM)表達(dá),闡明細(xì)胞內(nèi)酸化與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系。并在制模前后分別加用神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)干預(yù),明確 NGF可能通過激活 NHE1來抑制神經(jīng)元凋亡,起到神經(jīng)保護(hù)的作用,從而為NHE1激活劑應(yīng)用于 AD的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑 Aβ25-35、胎牛血清、馬血清、DMEM、F12培養(yǎng)基、兔抗 CaM單克隆抗體、兔抗NHE1單克隆抗體,以上藥品試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;酸堿度熒光探針 2',7'-二(羧乙基)-5(6)羧基熒光黃酯(BCECF/AM)購自Calbiochem公司。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng) 取出生 24h內(nèi)的 SD大鼠乳鼠(遼寧醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供),75%酒精浸泡消毒,無菌條件下取出大腦皮層,置于培養(yǎng)基中,剔除血管和軟腦膜,剪成 1mm3左右的小塊。加入 0.125%胰蛋白酶 37℃消化 10min。待細(xì)胞分散后,加入含 10%胎牛血清和 10%馬血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。200目篩網(wǎng)過濾,1000轉(zhuǎn)離心 10min,用含 10%胎牛血清和 10%馬血清的DMEM/F12制成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為 1×105～1×106/ml,接種在鋪有 L-多聚賴氨酸的 6孔培養(yǎng)板中,置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng) 48h后加入含阿糖胞苷(終濃度為 5mg/L)的培養(yǎng)基,抑制非神經(jīng)元細(xì)胞增殖。以后每 3d換液一次,培養(yǎng)7d后加用 Aβ25-35處理,并按不同的實驗分組加用NGF處理。

1.2.2 構(gòu)建 AD細(xì)胞模型 AD組:利用Aβ25-35誘導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞建立 AD細(xì)胞模型,Aβ25-35終濃度為 20μmol/L,接觸 24h。 NGF預(yù)防組:加用 Aβ25-35前 72h加用 NGF培養(yǎng),NGF終濃度為50μg/L。 NGF治療組:加入 Aβ25-35片段接觸 24h后加用 NGF繼續(xù)培養(yǎng),NGF終濃度 50μg/L。以上各組在 Aβ25-35脫離接觸后 12、24、48、72h收集細(xì)胞用于實驗。

1.2.3 Aβ25-35的孵育 選擇 Aβ25-35片段,用三蒸水配制成 100μmol/L,過濾,分裝,-20℃凍存,使用前老化處理并配制成所需濃度(將 Aβ25-35溶解在DMSO中,再用 DMEM稀釋,置于 37℃下孵育 7～14d,即為老化處理)。

1.2.4 Western印跡分析法測 NHE1及 CaM表達(dá) 將收集的細(xì)胞用冷的 PBS沖洗,放入預(yù)冷的裂解緩沖液中裂解,用 Lowry法測定蛋白質(zhì)含量,電泳后將 PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF(硝酸纖維素膜)上,取出后將膜放入 3%BSA阻斷緩沖液中,封閉 60min,TBS洗膜 3次,將膜放入一抗中(1∶500稀釋),4℃過夜。TTBS沖洗后,將膜放入二抗(1∶500稀釋)中,室溫孵育 1～2h,用 TTBS洗膜 3次,最后用 TBS洗膜一次,放入 NBT/BCIP顯色液中避光顯色,直至染色出現(xiàn),終止反應(yīng)。將蛋白印跡顯影圖掃描,利用凝膠自動分析成像軟件 Chem Image 5500對蛋白帶進(jìn)行灰度值分析。以上試驗步驟重復(fù) 3次。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi) pH值的測定

1.2.5.1 制定標(biāo)準(zhǔn)曲線 用 DMEM培養(yǎng)液清洗細(xì)胞 2次,加入終濃度 1μg/ml熒光染料 BCECF/AM,37℃孵育 30min,清洗 3次后重新懸浮于 pH值分別為 6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6的 KCl溶液(25mmol/L HEPES,145mmol/L KCl,0.8mmol/L MgCl2,1.8mmol/L CaCl2,5.5mmol/L葡萄糖),加入1μg/ml尼爾尼亞素,37℃孵育 10min,立即用激光共聚焦顯微鏡檢測,以氬激光 488nm激發(fā)細(xì)胞內(nèi)BCECF,檢測相應(yīng)細(xì)胞 530nm和 640nm發(fā)射熒光,求出熒光比值,做出 pH值與熒光比值之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線,pH與 530nm/640nm熒光比值之間有良好的線性關(guān)系(r＞0.995)。

1.2.5.2 細(xì)胞內(nèi) pH值測定 收集 5×106/ml細(xì)胞,用 DMEM培養(yǎng)基清洗 3次,加入 1μg/ml熒光染料 BCECF/AM,37℃孵育 30min,清洗 3次后上機(jī)檢測,記錄 530nm與 640nm發(fā)射熒光,求出兩者的比值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線推算細(xì)胞內(nèi) pH值。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)用(均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,實驗重復(fù) 5次,用 SPSS 11.5軟件包進(jìn)行分析,兩組間比較采用 LSD,s post hoc test進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,以 P＜0.05表示差異有顯著性;P＜0.01表示差異非常顯著。

2 結(jié) 果

2.1 各時間點 Western-blot結(jié)果比較

2.1.1 與 Aβ25-35組比較 NGF預(yù)防組內(nèi) NHE1具有高表達(dá)性,與 Aβ25-35組有顯著差異(P＜0.01);與 Aβ25-35組比較,NGF治療組內(nèi) NHE1具有高表達(dá)性,與對照組有顯著差異(P＜0.01),而且隨培養(yǎng)時間的延長各組內(nèi) NHE1表達(dá)均有不同程度的增強(qiáng)(見圖1、表1)。

2.1.2 與 AD組比較 NGF預(yù)防組內(nèi) CaM具有低表達(dá)性,與 AD組有顯著差異(P＜0.01);與AD組比較,NGF治療組內(nèi)除加用神經(jīng)生長因子 12h時與對照組比較 CaM表達(dá)差異無顯著性外,其余各時間點及處理因素下與對照組比較均有低表達(dá)性,與AD組有顯著差異(P＜0.01)(見圖2、表2)。

2.2 各時間點神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi) pH值比較 各組神經(jīng)細(xì)胞內(nèi) p H隨培養(yǎng)時間延長均呈降低趨勢,各時間點比較 NGF預(yù)防組及治療組細(xì)胞內(nèi) pH降低幅度較 AD組細(xì)胞低,兩組比較有明顯差異(P＜0.01,P＜0.05)(見表3)。

表1 各時間點 NHE1(130k Da)的表達(dá)±s)

表1 各時間點 NHE1(130k Da)的表達(dá)±s)

與 AD組比較*P＜0.01,△P＜0.05

AD組NGF預(yù)防組NGF治療組3.38±0.215.63±0.45*4.03±0.35△4.40±0.336.71±0.79*5.44±0.37*5.62±0.777.80±0.56*6.67±0.65*6.64±0.577.92±0.78*7.77±0.23*

表2 各時間點 CaM(49k Da)的表達(dá) ±s)

表2 各時間點 CaM(49k Da)的表達(dá) ±s)

與 AD組比較*P＜0.01

AD組NGF預(yù)防組NGF治療組1.33±0.220.99±0.23*1.24±0.281.77±0.111.33±0.22*1.48±0.32*1.89±0.231.61±0.34*1.68±0.17*2.1±0.191.80±0.11*1.90±0.24*

表3 各時間點神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)pH值比較 ±s)

表3 各時間點神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)pH值比較 ±s)

與 AD組比較*P＜0.01,△P＜0.05

AD組NGF預(yù)防組NGF治療組6.92±0.127.07±0.11*6.97±0.28△6.75±0.227.03±0.22*6.92±0.32*6.71±0.176.94±0.34*6.91±0.17*6.74±0.256.88±0.11*6.81±0.23*

圖1 NHE1的 Western-blot檢測

圖2 CaM的 Western-blot檢測

3 討 論

阿爾茨海默病(AD)是一種進(jìn)行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病,嚴(yán)重影響患者的工作能力和生活質(zhì)量,也為家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。關(guān)于 AD的發(fā)病進(jìn)展存在許多假說,如老年變性病、遺傳、病毒感染、炎癥、鋁中毒[4]、膽堿系統(tǒng)功能缺陷、細(xì)胞骨架改變及顱腦外傷等假說,但均不完善,針對以上病因采取的抗炎、抑制膽堿酯酶、調(diào)控退化谷氨酸能神經(jīng)元的突觸活性及擴(kuò)血管改善供血、營養(yǎng)神經(jīng)和抗氧化治療等治療措施,也僅是對癥治療,不能延緩病程的進(jìn)展。因此,尋找針對病因的治療藥物和手段,是當(dāng)今研究的難點和熱點。深入研究 AD的發(fā)病機(jī)制和治療措施成為醫(yī)務(wù)工作者刻不容緩的責(zé)任。

AD的主要病理特征為老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、區(qū)域選擇性神經(jīng)元數(shù)目減少和顆?？张葑冃?神經(jīng)元細(xì)胞減少與神經(jīng)系統(tǒng)的不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)元凋亡有關(guān)[1]。由于各種物理和化學(xué)刺激因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡都同時出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)酸化,細(xì)胞酸化與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系就成為人們關(guān)注的熱點[5,6]。Ibarreta D[7]等利用 AD患者的淋巴母細(xì)胞研究證明,α-IgM誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)酸化在 AD更為明顯,這就說明 AD患者的淋巴母細(xì)胞對酸負(fù)荷后細(xì)胞內(nèi) H+緩沖能力和質(zhì)子外流率都降低。本實驗中無論 AD組還是 NGF治療組、NGF預(yù)防組隨造模時間的延長,細(xì)胞內(nèi) pH值持續(xù)降低,AD組 pH值降低趨勢尤其明顯,以上研究結(jié)果說明,細(xì)胞內(nèi)的 p H降低在 AD的病理生理進(jìn)程中起著重要作用。

鈉氫離子交換蛋白(Na+/H+Exchanger,NHE)是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的細(xì)胞膜蛋白,它是存在于所有真核細(xì)胞的一種跨膜蛋白,該蛋白涉及細(xì)胞的多種功能,包括調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi) pH值(intracellur pH,pHi)、細(xì)胞體積的控制以及離子轉(zhuǎn)運等。Urcelay E等[8]研究證明,AD患者淋巴母細(xì)胞細(xì)胞膜上 NHE的激活可以促進(jìn)淋巴母細(xì)胞的增殖,這種效應(yīng)與表面受體介導(dǎo)的鈣調(diào)蛋白信號途徑有關(guān),它可以被 NHE的抑制劑所抑制。NHE激活或表達(dá)增多,可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的 p H升高,而 NHE的抑制或表達(dá)下調(diào),則使細(xì)胞內(nèi)的 pH降低,細(xì)胞酸化。本實驗中各組細(xì)胞隨模上NHE1表達(dá)的增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi) p H值下降趨勢減慢,但并沒完全停止,更沒有出現(xiàn)隨 NHE1表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi) pH上升的情況,這說明在實驗時間段內(nèi) NHE1表達(dá)增強(qiáng)不能完全對抗 Aβ25-35誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的毒性作用。越來越多的資料表明鈣調(diào)蛋白與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān),AD的發(fā)生已被證實部分是由于腦細(xì)胞內(nèi) CaM以及依賴于 CaM的激酶(PKC,PLA)等活性增高所致[9]。NHE1的 C端功能域存在與鈣調(diào)蛋白結(jié)合的兩個位點,鈣調(diào)蛋白能與 NHE1特異性結(jié)合,是其必要的活性調(diào)節(jié)亞單位,CaM的啟動與激活可抑制 NHE表達(dá)。實驗結(jié)果顯示隨造模時間的延長各組內(nèi)細(xì)胞 CaM與 NHE1的表達(dá)均是持續(xù)性增強(qiáng)的,這可能 Aβ25-35的細(xì)胞毒性持續(xù)作用有關(guān)。

神經(jīng)生長因子(NGF)是最早發(fā)現(xiàn)和最典型的神經(jīng)營養(yǎng)因子,其生物學(xué)效應(yīng)可以分為神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)系統(tǒng)兩大類,有促進(jìn)神經(jīng)元分化、保護(hù)效應(yīng)神經(jīng)元、誘導(dǎo)神經(jīng)纖維定向生長和再生等多種效應(yīng)。本實驗各組數(shù)據(jù)顯示,NGF預(yù)防組與 NGF治療組內(nèi)NHE1均具有高表達(dá)性,與 AD組比較有顯著差異(P＜0.01,P＜0.05),而且隨培養(yǎng)時間的延長各組內(nèi)NHE1表達(dá)均有不同程度的增強(qiáng)。這說明作為NHE1激動劑,神經(jīng)生長因子作用明顯。與 NHE1表達(dá)相對應(yīng),在 NGF作用下,預(yù)防組及治療組內(nèi) pH值較 AD組明顯增高,差異具有顯著性(P＜0.01)。相反,NGF預(yù)防組與治療組內(nèi)各時間點細(xì)胞 CaM表達(dá)較 AD組明顯要低,差異有顯著性(P＜0.01)。以上研究結(jié)果說明神經(jīng)生長因子能顯著增強(qiáng) NHE1表達(dá),有效地對抗 Aβ25-35對離體培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞的毒性作用。

總之,神經(jīng)生長因子可通過增強(qiáng)細(xì)胞膜上 NHE1的表達(dá),有效地提高細(xì)胞內(nèi) pH值,對抗 Aβ25-35對離體培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞的毒性作用,達(dá)到抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的目的。神經(jīng)生長因子分子量大,不易通過血腦屏障,這是神經(jīng)生長因子應(yīng)用于 AD治療的最大的困擾。相信隨著受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運的經(jīng)鼻腔腦靶向給藥、促進(jìn)內(nèi)源性 NGF合成的化合物、增強(qiáng)內(nèi)源性NGF作用的化合物、NGF基因治療、NGF聯(lián)合治療等幾方面研究[10]的不斷進(jìn)展,神經(jīng)生長因子及其它類型的 NGF激動劑如咪唑等在 AD治療中得到應(yīng)用。

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