張春霞, 何明霞, 李加智, 王進(jìn)強(qiáng), 蔣桂芝, 侯建勇

(云南省熱帶作物科學(xué)研究所,景洪 666100)

橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌的生物學(xué)特性

張春霞*, 何明霞, 李加智, 王進(jìn)強(qiáng), 蔣桂芝, 侯建勇

(云南省熱帶作物科學(xué)研究所,景洪 666100)

通過對(duì)橡膠多主棒孢進(jìn)行生物學(xué)特性研究,結(jié)果表明:菌絲生長的適宜溫度范圍為25～30℃,最適溫度為30℃;最適pH范圍為4～8;菌絲在以麥芽糖為碳源和以KNO3為氮源的培養(yǎng)基上生長最好。分生孢子萌發(fā)的適宜溫度范圍為20～35℃,最適溫度為25℃;水滴是孢子萌發(fā)的必要條件;在不同的pH條件下分生孢子萌發(fā)無明顯差異;分生孢子在果糖中萌發(fā)率最低。

橡膠樹; 多主棒孢; 生物學(xué)特性

橡膠棒孢霉落葉病[Corynespora cassiicola(Berk.&Curt.)Wei]是橡膠樹的一種毀滅性病害,主要侵染葉片、枝條,造成橡膠樹周年反復(fù)落葉甚至幼樹死亡,嚴(yán)重降低干膠產(chǎn)量[1]。2007年,蒲金基等在海南的儋州和云南的河口地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)了棒孢霉落葉病在苗圃和幼齡樹上危害[2]。目前橡膠棒孢霉落葉病在云南農(nóng)墾集團(tuán)公司所屬的東風(fēng)、勐醒、勐捧、勐臘、勐滿、河口 、文山、德宏、景洪等橡膠分公司和云南省熱作所均有發(fā)生。病害的發(fā)生以苗圃地為重,據(jù)云南河口分公司調(diào)查,2007年6月,在一個(gè)橡膠苗圃林地發(fā)生了大面積黃葉,后經(jīng)確診為橡膠樹棒孢霉落葉病,隨后在割膠林地也發(fā)現(xiàn)棒孢霉落葉病,感病面積34.07 hm2。由于是新病害,還沒有找出最有效的控制藥劑,加上持續(xù)陰雨潮濕天氣,至2007年11月底,感病面積擴(kuò)大到57.73 hm2,其中割膠林地43.13 hm2,幼林地1.6 hm2,苗圃地13 hm2,最高發(fā)病率達(dá)94%[3-4]。為了開展后續(xù)研究,作者研究了橡膠多主棒孢生物學(xué)特性,以下報(bào)道該研究結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 供試菌種

從西雙版納東風(fēng)橡膠分公司采集發(fā)生橡膠棒孢霉落葉病的葉片,按常規(guī)方法進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng),并依據(jù)柯赫氏法則[5]進(jìn)行病原菌的確定。本試驗(yàn)均采用淡綠期的同品種橡膠葉片。選擇完好無病斑的健康葉片,用針刺法和噴霧法進(jìn)行接種鑒定[6]。針刺法是用一簇參差不齊的大頭針將葉片刺傷后,用打孔器取直徑為4 mm的菌塊,將有菌絲的一面貼在傷口上,用濕棉球保濕,25℃培養(yǎng),以水瓊脂塊為對(duì)照。噴霧法是采用濃度為3×105個(gè)/mL的孢子懸浮液均勻噴灑到橡膠葉片上至表面形成一層小水滴,25℃保濕培養(yǎng),以清水為對(duì)照。觀察人工接種的病葉是否表現(xiàn)出和田間相同的癥狀,是否能再分離到相同的致病菌,確定病原菌。然后單孢分離,保存菌株。

1.2 不同條件對(duì)菌絲生長的影響

1.2.1 不同溫度對(duì)菌絲生長的影響

用打孔器取4 mm已純化的菌塊置于Czapek(查氏培養(yǎng)基)平板上 ,然后放在 5、10、15、20、25、28、30、35、38、40 ℃恒溫培養(yǎng) 。6 d后采取十字交叉法測(cè)量菌落直徑,每處理3皿。

1.2.2 不同pH對(duì)菌絲生長的影響

經(jīng)滅菌后的Czapek培養(yǎng)基,冷卻至55℃,以滅菌的0.1 mol/L HCL和0.1 mol/L NaOH進(jìn)行pH調(diào)節(jié),制成pH3～10的培養(yǎng)基在最適溫度下培養(yǎng)。6 d后采取十字交叉法測(cè)量菌落直徑,每處理3皿。

1.2.3 不同光照對(duì)菌絲生長的影響

用打孔器取4 mm已純化的菌塊置于Czapek平板上,選定一個(gè)最適宜多主棒孢生長的溫度,分別置于連續(xù)光照、12 h明暗交替、完全黑暗3種光照條件下培養(yǎng),6 d后測(cè)量菌落直徑,每處理3皿。

1.2.4 不同碳源對(duì)菌絲生長的影響

以Czapek為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別以可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖和果糖等量替換其中的蔗糖,制成相同含糖量不同碳源的培養(yǎng)基,經(jīng)高壓滅菌后接種,其他處理同上。

1.2.5 不同氮源對(duì)菌絲生長的影響

以Czapek為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別以KNO3、硫酸銨、草氨酸、甘氨酸、尿素等量替換其中的NaNO3,做成不同氮源的培養(yǎng)基,經(jīng)高壓滅菌后接種,其他處理同上。

1.3 不同條件對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

1.3.1 溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

用無菌水洗下Czapek平板上產(chǎn)生的分生孢子,配成低倍鏡下每視野20～30個(gè)孢子的懸浮液,滴于凹面載玻片上,然后置于 5、10、15 、20、25、30、35、40℃下保濕培養(yǎng),7 h后鏡檢并統(tǒng)計(jì)分生孢子萌發(fā)率。每處理3次重復(fù)。

1.3.2 pH對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

用0.1 mol/L HCL和0.1 mol/L NaOH調(diào)配pH3～10的緩沖液,分別配制孢子懸浮液,滴于凹面載玻片上,30℃保濕培養(yǎng)。7 h后鏡檢并統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。每處理3次重復(fù)。

1.3.3 碳源對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

用無菌水配制2%可溶性淀粉溶液、2%麥芽糖溶液、2%乳糖溶液、2%甘露醇溶液、2%葡萄糖溶液和2%果糖溶液,分別配制孢子懸浮液,7 h后鏡檢并統(tǒng)計(jì)各自的孢子萌發(fā)率。

1.3.4 濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

配制孢子懸浮液,然后將其涂在滅菌的載玻片上,陰干后放于用濃硫酸和水配成的不同濕度(10%、25%、50%、75%、90%)的干燥器中,25 ℃培養(yǎng)7 h檢測(cè)孢子萌發(fā)率。以水滴為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性測(cè)定

用針刺法和噴霧法對(duì)橡膠葉片接種4 d后,均形成本病特征性的“魚骨”或“鐵軌”狀病斑。噴霧法接種比針刺法接種病斑直徑更大。室內(nèi)接種癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相似。對(duì)接種成功的病斑進(jìn)行組織分離,獲得多主棒孢,依據(jù)柯赫氏法則可以斷定橡膠棒孢霉落葉病是由多主棒孢引起的。

2.2 不同條件對(duì)橡膠多主棒孢菌絲生長的影響

2.2.1 溫度對(duì)橡膠多主棒孢菌絲生長的影響

從圖1可以看出,橡膠多主棒孢菌絲在10～38℃范圍內(nèi)均能生長,適宜溫度范圍為25～30℃,最適溫度為30℃,在10℃和38℃菌絲生長受到明顯抑制,5℃和40℃菌絲停止生長。

圖1 溫度對(duì)橡膠多主棒孢菌絲生長的影響

2.2.2 pH對(duì)橡膠多主棒孢菌絲生長的影響

從圖2可以看出,橡膠多主棒孢對(duì)酸堿度的適宜范圍很廣,菌絲在pH為3～10的范圍內(nèi)均能生長。最適范圍為pH4～8。pH3時(shí),菌絲生長速度減慢。pH＞8時(shí),隨著堿性增大菌絲生長減慢。

圖2 pH對(duì)橡膠多主棒孢菌絲生長的影響

2.2.3 光照對(duì)橡膠多主棒孢菌絲生長的影響

從圖3可以看出,在全光照和光暗交替的條件下,菌絲生長有明顯差異。光暗交替條件下,菌落直徑相對(duì)較大,為46.93 mm。

圖3 光照對(duì)橡膠多主棒孢菌絲生長的影響

2.2.4 碳源對(duì)橡膠多主棒孢菌絲生長的影響

從圖4可以看出,多主棒孢能利用多種碳源,在以麥芽糖和乳糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長無明顯差異,但在麥芽糖上菌落顏色更深,長勢(shì)更好。雖然在葡萄糖和甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上菌絲直徑無顯著差異,但在甘露醇上菌落長勢(shì)差,稀疏,而且顏色淺。在其余3種碳源培養(yǎng)基上,菌絲生長有明顯差異。多主棒孢對(duì)果糖的利用能力最差。

圖4 碳源對(duì)橡膠多主棒孢菌絲生長的影響

2.2.5 氮源對(duì)橡膠多主棒孢菌絲生長的影響

從圖5可以看出,多主棒孢對(duì)KNO3和NaNO3的利用效果明顯優(yōu)于其他氮源,以對(duì)KNO3的利用效果最好。其次為草氨酸和甘氨酸,在這2種氮源培養(yǎng)基上菌絲生長無明顯差異。多主棒孢對(duì)硫酸銨的利用效果最差。

圖5 氮源對(duì)橡膠多主棒孢菌絲生長的影響

2.3 不同條件對(duì)橡膠多主棒孢孢子萌發(fā)的影響

2.3.1 溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

從圖6可以看出,橡膠多主棒孢分生孢子在10～40℃范圍內(nèi)均能萌發(fā),適宜范圍為20～35℃,最適溫度為25℃。低于20℃和高于35℃孢子萌發(fā)受到明顯的抑制,5℃孢子不萌發(fā)。

圖6 溫度對(duì)橡膠多主棒孢孢子萌發(fā)的影響

2.3.2 pH對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

從圖7可知,橡膠多主棒孢分生孢子在 pH 3～10均可萌發(fā),說明其對(duì)pH的適應(yīng)范圍較廣。與橡膠多主棒孢菌絲生長對(duì)pH的適應(yīng)性一致。pH4時(shí)孢子萌發(fā)率最高,達(dá)92.7%。

圖7 pH對(duì)橡膠多主棒孢孢子萌發(fā)的影響

2.3.3 碳源對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

從圖8可以看出,分生孢子在淀粉、乳糖、甘露醇和麥芽糖中的萌發(fā)率沒有顯著差異,在果糖中萌發(fā)率最低,僅為19.3%。不管是菌絲生長還是孢子萌發(fā),橡膠多主棒孢對(duì)果糖的利用效果都是最差的。

圖8 不同碳源對(duì)橡膠多主棒孢孢子萌發(fā)的影響

2.3.4 濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

保濕培養(yǎng)7 h后,分生孢子在10%、25%、50%、75%和90%的相對(duì)濕度下均不萌發(fā),僅在水滴中才能萌發(fā)。說明分生孢子萌發(fā)需要高濕條件。

3 結(jié)論與討論

橡膠多主棒孢生物學(xué)特性研究表明,多主棒孢菌絲在 10～38℃范圍內(nèi)均能生長,最適溫度是30℃,最適的pH范圍為4～8,該結(jié)果與劉鳴韜等人對(duì)黃瓜靶斑病菌[Corynespora cassiicola(Berk.&Curt.)Wei]的報(bào)道一致[6]。在光暗交替的條件下,菌絲生長相對(duì)較快,這說明自然光照很適宜菌絲的生長。多主棒孢菌絲在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上生長最好,對(duì)果糖的利用效果最差;在KNO3為氮源的培養(yǎng)基上生長最好,對(duì)硫酸銨的利用效果最差。孢子萌發(fā)需要的最佳溫度為25℃,最適pH為4。分生孢子在淀粉、乳糖、甘露醇和麥芽糖的萌發(fā)率都在74%以上,在果糖中的萌發(fā)率最低。分生孢子僅在水滴中才能萌發(fā)。

從該病在苗圃地的發(fā)生情況來看,橡膠棒孢霉落葉病在苗圃全年均可發(fā)生,這與多主棒孢在10～38℃范圍內(nèi)菌絲均能生長是一致的。田間環(huán)境條件有利于病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā),橡膠棒孢霉落葉病的發(fā)生就會(huì)嚴(yán)重。

[1]張欣,蒲金基,謝藝賢,等.巴西橡膠樹棒孢霉落葉病發(fā)生情況調(diào)查[J].植物檢疫,2007,21(6):372-373.

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Biological characteristics of Corynespora cassiicola causing Corynespora leaf fall disease

Zhang Chunxia, He Mingxia, Li Jiazhi, Wang Jinqiang, Jiang Guizhi, Hou Jianyong
(Yunnan Tropical Crops Research Institute,Jinghong666100,China)

The biological characteristics ofCorynespora cassiicolawas reported in this paper.The results showed that the optimum temperature for mycelial growth is 25-30℃,but 30℃is the most suitable temperature.The optimum pH is 4-8.The mycelium ofCorynespora cassiicolagrew well on the media with maltose as the carbon sources.KNO3is the best nitrogen source.The optimum temperature for conidial germination is 20-35℃,but 25℃is the most suitable temperature.Water drop is necessary for conidial germination.Conidial germination had no obvious effects between different pH media.Conidia germinated at a lower rate on the media using fructose as the carbon sources.

rubber tree;Corynespora cassiicola; biological characteristics

S 435.76

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2010.02.021

2009-03-24

2009-04-17

云南省農(nóng)墾集團(tuán)項(xiàng)目(2008XJ01)

*通信作者Tel:0691-2142682;E-mail:zhangchunxia7084@163.com