李賢宇，張蕊，周博

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300402）

酪酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

李賢宇，張蕊，周博

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300402）

酪酸菌為人和動物腸道內(nèi)正常菌群中的一種有益菌，能產(chǎn)生各種維生素，對人體具有保健作用，酪酸菌的芽孢是一種較理想有開發(fā)前景的微生態(tài)制劑。制備酪酸菌微生態(tài)制劑首先要實現(xiàn)酪酸菌的高密度培養(yǎng)，其次是獲得較高酪酸菌芽孢轉(zhuǎn)化率，本文對酪酸菌的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，取得良好的效果。

酪酸菌；培養(yǎng)條件；優(yōu)化

酪酸梭狀芽孢桿菌（酪酸菌），又稱丁酸菌，是1933年由日本千葉醫(yī)科大學(xué)宮入近治博士首先發(fā)現(xiàn)并報告的[1]。該菌在于土壤、酸奶、動物和人體的腸道等厭氧環(huán)境中，菌體為直或微彎曲，大小為0．6～1．2×3．0～7．0 μ，端圓，周生鞭毛，能運動。菌體中常有圓形或橢圓形芽孢，菌體中部膨大呈梭形，芽孢偏心或次端生、無芽孢外壁或附屬絲。

酪酸菌為人和動物腸道內(nèi)正常菌群中的一種有益菌[2，3]，能夠大量補充腸道內(nèi)正常菌群的數(shù)量，促進其它有益菌群的增殖；能產(chǎn)生B族維生素、維生素K、丁酸等物質(zhì)，對人體具有保健作用。并能在腸粘膜表面形成微生物屏障，阻止有害菌的定植和入侵，有效地改善腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，是一種較理想的有開發(fā)前景的微生態(tài)制劑。制備酪酸菌微生態(tài)制劑首先要實現(xiàn)酪酸菌的高密度培養(yǎng)，其次是獲得較高酪酸菌芽孢轉(zhuǎn)化率，因此，使酪酸菌的培養(yǎng)濃度和芽孢轉(zhuǎn)化率均獲得較大幅度的提高。已成為研究和開發(fā)酪酸菌微生態(tài)制劑的關(guān)鍵。本文就此實驗對酪酸菌的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

菌種：酪酸菌，天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室分離保藏菌種。

主要儀器：高速離心機（北京醫(yī)用離心機廠），磁力攪拌器，氮氣鋼瓶。

1.2 實驗方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏3 g，葡萄糖5 g，氯化鈉5 g，可溶性淀粉1 g，L-半光氨酸鹽0．5 g，乙酸鈉3 g，溶于1000 mL水中，調(diào)pH7．5。

1.2.2 菌體濃度的測定

采用活菌計數(shù)法，取1 mL發(fā)酵液加入到9 mL滅菌的生理鹽水中，依次做10倍梯度稀釋，選取三個適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，吸取1 mL稀釋液注入無菌培養(yǎng)皿中，傾注法加入15 mL培養(yǎng)基混勻，每個稀釋度做三個平行培養(yǎng)皿。待培養(yǎng)基凝固后，倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。選取菌落在30～300之間的培養(yǎng)皿計菌落數(shù)。

1.2.3 芽孢濃度的測定

取菌液5 mL，于80℃水浴加熱10 min，殺死營養(yǎng)體細胞，然后采用上述活菌計數(shù)法計數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酪酸菌接種量對菌體濃度的影響

接種量大小對培養(yǎng)結(jié)果有一定影響，接種量過大會帶入較多的種子培養(yǎng)期的代謝產(chǎn)物，并使菌體前期生長過快，從而會造成培養(yǎng)后期的代謝副產(chǎn)物大量累積，使最終菌濃有所降低；接種量過小則使菌體增殖緩慢，培養(yǎng)時間延長。

實驗分別采用了2%、5%、10%和15%四個接種量進行培養(yǎng)，培養(yǎng)20 h后結(jié)果見圖1。由圖1可知，在培養(yǎng)20 h之后，15%接種量組已進入穩(wěn)定期，但菌體濃度并不是最高；2%和5%接種量組仍處于指數(shù)期，生長過慢；而10%的接種量可使菌濃達到較高水平。

圖1 接種量對菌濃的影響

2.2 培養(yǎng)溫度對菌體濃度及芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

選不同的培養(yǎng)溫度進行實驗比較，菌體的生長情況和芽孢轉(zhuǎn)化率如圖2所示。從圖2可知，酪酸菌生長的最適溫度為37℃，較高或者較低的溫度對酪酸梭狀芽孢桿菌的生長影響較大；但當(dāng)溫度低于或者高于37℃時，菌體的芽孢轉(zhuǎn)化率卻有所增加。

圖2 培養(yǎng)溫度對酪酸菌生長及芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

為了在不降低菌體濃度的情況下提高芽孢轉(zhuǎn)化率，實驗采用了兩步培養(yǎng)法。首先在37℃培養(yǎng)，待菌體到達穩(wěn)定期后，適當(dāng)?shù)慕档突蛘咛岣吲囵B(yǎng)溫度，芽孢的轉(zhuǎn)化率如表1所示。從表1可以看出，當(dāng)酪酸菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期（20 h）后，溫度降至30℃繼續(xù)培養(yǎng)至32 h時，所得到的芽孢生成率可達95%；升高溫度也有利于芽孢的形成，但當(dāng)溫度高于40℃時，菌體死亡很快，最終雖然獲得的芽孢生成率較高，但由于菌體數(shù)目的大幅度減少，芽孢的總體收率降低。

表1 20 h后改變培養(yǎng)溫度對芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

2.3 氮氣保護實驗

對于專性厭氧菌——酪酸梭狀桿菌來說，對其生長造成強烈影響的是進入三角瓶中的空氣以及該部分氣體和發(fā)酵液的混合程度。由于實驗過程中間斷性地進行取樣，帶入空氣不可避免，為了消除這兩個方面的影響，實驗采用了氮氣保護和發(fā)酵栓同時使用的方法，實驗裝置如圖3所示。

圖3 氮氣保護實驗裝置

以10%接種量接種后，安裝好發(fā)酵栓，打開進氣閥門通入氮氣，將滯留在三角瓶內(nèi)的空氣趕出，然后關(guān)閉進氣閥（每次中間取樣結(jié)束后重復(fù)此步操作）。將培養(yǎng)裝置放入?yún)捬跸?，并開啟磁力攪拌器輕微攪拌，分別測定兩種情況下的菌體濃度：（1）每隔2 h取樣一次，培養(yǎng)20 h后測定菌體濃度；（2）培養(yǎng)過程中不取樣，培養(yǎng)20 h后測定菌體濃度。并與靜置培養(yǎng)比較，如圖4所示。

圖4 兩種培養(yǎng)方式下菌體濃度比較

從圖4中可以看出，靜置培養(yǎng)時，酪酸菌的菌濃要比采用發(fā)酵拴進行氮氣保護培養(yǎng)時低得多，其主要原因是由于后者使用了磁力攪拌，使培養(yǎng)液與菌體均勻混合，促進了菌體與培養(yǎng)液之間的物質(zhì)交換。如果每2 h取樣一次，靜置培養(yǎng)由于受進入三角瓶內(nèi)空氣的影響，菌濃下降幅度較大；而對于氮氣保護實驗而言，整個培養(yǎng)過程中取不取樣對菌濃的影響不大。由此可見，氮氣保護實驗很好的消除了由于間斷取樣造成的氧對酪酸菌生長的危害。

2.4 培養(yǎng)時間的確定

將菌種接種于上述培養(yǎng)基中，依照上述培養(yǎng)條件，采用發(fā)酵栓進行氮氣保護培養(yǎng)實驗，每隔2 h對培養(yǎng)期間的菌濃、pH值和芽孢轉(zhuǎn)化率進行取樣測定，結(jié)果如圖5所示。從圖5可看出菌體的最高濃度出現(xiàn)在20 h；芽孢的最大轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)在36 h，但此時由于菌體的濃度下降幅度較大，并不是芽孢的最佳收獲時期，綜合考慮，芽孢的最佳收獲時期應(yīng)在30～32 h之間。

圖5 酪酸菌的生長曲線圖

3 結(jié)論

3.1 單因子實驗表明，酪酸菌的最佳接種量為10%。

3.2 酪酸菌生長的最適溫度為37℃；但待菌體到達穩(wěn)定期后，適當(dāng)?shù)慕档团囵B(yǎng)溫度卻有利于芽孢的形成。當(dāng)酪酸菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期（20h）后，溫度降至30℃繼續(xù)培養(yǎng)至32h時，所得到的芽孢生成率可達95%。

3.3 對于專性厭氧菌——酪酸梭狀桿菌來說，對其生長造成強烈影響的是進入三角瓶中的空氣以及該部分氣體和發(fā)酵液的混合程度。由于實驗過程中間斷性地進行取樣，帶入空氣不可避免。實驗采用氮氣保護和發(fā)酵栓同時使用的方法，很好地消除了由于間斷取樣造成的氧對酪酸菌生長的影響。

3.4 酪酸菌的生長曲線表明，細胞的最佳收獲時間為20 h、芽孢的最佳收獲時間為30～32 h之間。

［1］ 莊志發(fā)，馮紫慧.簡述微生態(tài)活菌（酪酸菌）制劑的研究應(yīng)用[J].山東食品發(fā)酵，1999，（1）：32～35.

［2］ John Marinko,Michael Madigan.Brock Biology of microorganisms [M].Prentice Hall,2005.

［3］ 宋會儀，吳天星.酪酸菌微生態(tài)制劑的生物學(xué)功能及在飼料中的應(yīng)用[J].飼料工業(yè)，2006，27（12）：10～11.

Optimization of clostridiun butyricum culture condition

LI Xian-yu,ZHANG Rui,ZHOU Bo
(Tianjin Bohai Vocatinal Technical College,Tianjin 300402)

As a beneficial bacteria,clostridium butyricum can produce a variety of vitamins,and has a health care on the human body．The spores of Clostridium butyricum are ideal microecological agents which have development prospects．Clostridium butyricum high-density culture must be carried out first before the preparation of microecological agents,followed by a higher conversion rate of butyric acid bacteria spores．Clostridium butyricum culture conditions were optimized in this paper and achieved good results．

clostridium butyricum;culture conditions;optimization

book=3,ebook=22

10．3969/j．issn．1008-1267．2010．01．008

Q839.1

A

1008-1267（2010）01-0022-03

2009-10-12