劉 芳

(西南大學(xué)體育學(xué)院,重慶 400715)

運動調(diào)節(jié) CSE/H2S系統(tǒng)在實驗性 SD大鼠動脈粥樣硬化進程中的作用

劉 芳

(西南大學(xué)體育學(xué)院,重慶 400715)

探討動脈粥樣硬化進程中胱硫醚 -r-裂解酶/硫化氫 (CSE/H2S)系統(tǒng)的變化以及有氧運動對該系統(tǒng)的影響。方法:以實驗性動脈粥樣硬化 (atherosclerosis,AS)SD大鼠 16只做為動物模型,隨機分為M組 (運動組)每天游泳運動 30分鐘持續(xù) 8周 (n =8),和不做運動組N(n=8)。同時設(shè)正常對照組 C(n=8),給予普通飼料喂養(yǎng)。然后取靜脈血和主動脈組織,分別用沉淀漂浮酶聯(lián)法、和去蛋白法測定各實驗組血中 TC、TG、LDL、HDL、H2S含量,用亞甲基藍法主動脈組織中誘導(dǎo)型胱硫醚 -r-裂解酶的活性。結(jié)果:8周末與對照組比較,發(fā)現(xiàn)模型組M、N血脂水平明顯升高,血漿中H2S含量下降,CSE活性減少,與C組相比差異有顯著性。

動脈粥樣硬化;胱硫醚 -r-裂解酶;硫化氫;有氧運動

數(shù)百年來硫化氫 H2S一直被認(rèn)為是空氣和水源污染的重要污染物 ,內(nèi)源性 H2S為機體含硫氨基酸代謝終末廢物。近年研究發(fā)現(xiàn) H2S[1]是繼 NO和 CO之后發(fā)現(xiàn)的一種獨特的血管活性物質(zhì),在動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)進程中具有重要作用。內(nèi)源性的 H2S是以體內(nèi)含硫的氨基酸如半胱氨酸、蛋氨酸和同型半胱氨酸(Hcy)等為底物,被 5’-磷酸吡多醛依賴性酶包括胱硫醚 -β -合成 (cystathionine-β -synthase,CBS)、胱硫醚 -γ -裂解酶 (cystathionine-γ -lyase,CSE)和半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶催化作用下產(chǎn)生的。心血管組織內(nèi) H2S主要通過 CSE催化產(chǎn)生。H2S在血管組織以L-半胱氨酸為底物經(jīng)胱硫醚-γ-裂解酶 (cystathionine-γ-lyase,CSE)分解代謝而生成[2]。H2S可通過抑制MAPK信號途徑抑制血清及內(nèi)皮素誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖,通過激活caspase-3途徑誘導(dǎo)主動脈平滑肌細胞凋亡,維持血管正常結(jié)構(gòu)和功能[3]。因此,H2S可能減輕動脈粥樣硬化的發(fā)展。然而,食餌性大鼠 AS進程中及應(yīng)用有氧游泳運動后,CSE/H2S系統(tǒng)的變化情況尚不清楚。本研究在構(gòu)建高膽固醇飲食誘導(dǎo)的大鼠食餌性AS模型的基礎(chǔ)上 ,檢測了 CSE活性及 H2S生成量的變化 ,并應(yīng)用有氧運動進行調(diào)節(jié),旨在探討食餌性 AS進程中 ,CSE/H2S的變化規(guī)律,并探討有氧運動后對CSE/H2S系統(tǒng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與主要試劑

5’-磷酸吡多醛美國、PPG(炔丙基甘氨酸, p ropargy1-gycine,PPG內(nèi)源性 H2S合成酶的抑制劑)及硫氫化鈉 (hydrogen sulfide)均購于 Sigma公司。721A型分光光度計購于上海第三分析儀器廠。雄性 SD大鼠購自重慶市第三軍醫(yī)大實驗動物實驗中心。

1.2 AS模型的制備及動物實驗分組

雄性 SD大鼠16只,體重 180-200g,喂高脂飼料(2%膽固醇、10%蛋黃粉、5%豬油和 83%基礎(chǔ)飼料)8周后,隨機分為兩組M和N,游泳運動M和不運動N,每組 8只。同時選取 8只雄性 SD大鼠為正常對照組 C,給予普通飼料 120-140g/d喂養(yǎng) 8周。

1.3 各項生化指標(biāo)的測定

于實驗開始、8周末、禁食 12h以上,經(jīng)摘眼球取血備用。采用沉淀漂浮酶聯(lián)法檢測血漿中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)的含量。試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 血漿 H2S濃度測定

測定采用去蛋白法[4]在試管中加入 0.5 ml 1%醋酸鋅,然后加入 0.1 ml血漿標(biāo)本,振蕩混勻,使血漿中的硫離子與醋酸鋅充分反應(yīng)形成硫化鋅沉淀而固定下來;再依次加入 20 mmol/L對苯二胺鹽酸鹽 0.5 ml和 30 mmol/L三氯化鐵 0.5 ml,室溫孵育 20 min使之充分顯色。再加入 10%三氯醋酸 1 ml使蛋白沉淀下來,加 2.5 ml蒸餾水補足體積至 5 ml。6 000 r/ min離心 5 min,吸取上清液,用分光光度計在波長670 nm處檢測上清液的吸收度(A)值。根據(jù) H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線計算上清液中 H2S的含量。

1.5 主動脈組織中硫化氫合酶活性的測定

取新鮮剝離的大鼠主動脈或左心室肌組織 50 mg,去除外膜脂肪,用 50mmo/L磷酸緩沖液 (pH 6.8)在 Polytron勻漿器制備 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))組織勻漿,考馬斯亮藍蛋白定量后加入反應(yīng)液(100mmol/L磷酸緩沖液 pH7.4,10mmol/L左旋半胱氨酸,2mmol/L磷酸吡多醛),移至反應(yīng)瓶,反應(yīng)瓶中央的吸收孔中加入 0.5mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))醋酸鋅,并以濾紙浸入其中,以加大吸收面積。反應(yīng)瓶在封口前用氮氣吹 20s,將反應(yīng)瓶于 37℃水浴中孵育 90min,加入 0.5mL 50%三氯乙酸 37℃孵育 60min終止反應(yīng),反應(yīng)瓶中央孔的液體加入 3.5mL水,20mmol/L對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽0.5mL、30mmol/L三氯化鐵0.4mL,室溫靜置20min后于 670nm讀取吸光度(A)值[5]。配制NaHS作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算出組織中 H2S生成率,結(jié)果以 nmol/(min ·mg)表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用(x±s)表示,采用 SPSS15.0統(tǒng)計軟件和Origin7.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 血脂檢測結(jié)果

與正常對照組相比較,模型組M、N血脂水平明顯升高(P<0.01),游泳運動后,模型組M血漿 TC、TG、LDL水平明顯下降(表 1)。

表 1 實驗各組血脂測定結(jié)果(c/mmol·L-1±s)

表 1 實驗各組血脂測定結(jié)果(c/mmol·L-1±s)

﹡ P<0.01vs對照組;△P<0.01vs模型組

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2.2 有氧運動對血漿 H2S含量的影響

模型組M、N血漿H2S含量大幅度減少,與對照組C相比較差異有顯著性。第 8周后,運動模型組M血漿 H2S含量有所增加,并且高于了對照組水平 (見圖1)。

圖 1 實驗各組血漿 H2S測定結(jié)果(c/umol/L)

2.3 有氧運動對主動脈組織 CSE活性的影響

對照組 C在隨時間的變化中,主動脈組織 CSE活性沒有明顯的變化。模型組M、N隨著時間,主動脈組織 CSE活性不斷的降低,但是通過一定時間的有氧運動后,運動模型組M主動脈組織 CSE活性又不斷增加,并且高于了對照組 C(見圖 2、3)。

3 討論

動脈粥樣硬化是以富含脂肪的斑塊在大動脈壁聚積為特征的系統(tǒng)疾病,是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。動脈粥樣硬化病因病理復(fù)雜,目前尚未完全闡明。大量研究證明,氧化應(yīng)激是 AS的重要致病因素,因此,抗氧化物質(zhì)為 AS的治療帶來了新的曙光。血管系統(tǒng)中內(nèi)源性氣體信號分子是體內(nèi)重要的抗氧化體系,影響AS發(fā)生發(fā)展的許多病理過程。氣體信號分子合成酶與AS的關(guān)系已成為研究的熱點,具有可誘導(dǎo)性的氣體信號分子合成酶的調(diào)控有望成為AS防治的新手段。90年代后期研究表明,中樞的內(nèi)源性 H2S具有調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶和調(diào)節(jié)下丘腦 -垂體 -腎上腺素軸的功能,被認(rèn)為是一種非典型的神經(jīng)遞質(zhì)[6]。近年發(fā)現(xiàn)心血管組織表達CSE并利用L-Cys生成H2S,內(nèi)源性的H2S可開放 VSMC質(zhì)膜上 KATP通道 ,導(dǎo)致細胞膜超極化 ,舒張血管 ,降低血壓[7];并可通過抑制絲裂素活化蛋白激酶途徑抑制 VS MC的增殖[8],通過激活 Caspase-3途徑促進 VS MC凋亡[9]。心肌組織表達 CSE及MPST,產(chǎn)生的 H2S可通過 KATP通道開放產(chǎn)生負(fù)性肌力作用[10]。實驗研究證實 ,高血壓、心肌缺血、肺動脈高壓及休克等心血管病變時 ,心血管CSE/H2S通路明顯改變 ,給予 H2S的供體 (NaHS)或 CSE抑制劑 (DL-p r opargylglycine)后皆明顯影響疾病的發(fā)病過程及預(yù)后 ,提示內(nèi)源性 H2S可能是心血管調(diào)節(jié)的新型氣體信號分子[11-13]。胱硫醚 -γ-裂解酶(CSE)[14]是體內(nèi)清除同型半胱氨酸的關(guān)鍵酶,各種原因引起的 CSE活性降低、均可導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥。血液中高濃度的同型半胱氨酸可通過損傷血管內(nèi)皮細胞、改變血液的凝固狀態(tài)和血小板功能、刺激血管平滑肌細胞增殖和促進低密度脂蛋白氧化等參與 As的發(fā)生發(fā)展過程。

運動可以造成氧化應(yīng)激,但有規(guī)律有計劃的體育運動可以通過基因水平上調(diào)節(jié)氧化還原信號增強機體抗氧化能力。最近研究發(fā)現(xiàn),運動能誘導(dǎo)氣體信號分子相應(yīng)的合成酶合成,對動脈粥樣硬化病理形成和發(fā)展具有阻抑作用。利用氣體信號分子作為治療AS手段已引起人們關(guān)注。然而氣體信號分子合成酶的誘導(dǎo)劑大多具氧化毒性,對機體有損傷。轉(zhuǎn)基因雖有效,但在臨床卻不太可行。而有氧運動在防治 AS的積極作用已被部分基礎(chǔ)研究和臨床實踐所證實,有氧運動可通過多種途徑和機制對AS起防治作用。關(guān)于運動對氣體信號分子系統(tǒng)的影響,為數(shù)不多的研究表明,運動可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮、平滑肌、骨骼肌、白細胞中NOS、HO -1、CSE表達增多[15]。提示運動促進 NOS、HO-1、CSE的合成,可能是運動改善 AS的另一機制,直接證據(jù)尚需實驗證實[16-18]。目前還發(fā)現(xiàn)了 H2S與 NO和CO不同的是,H2S通過激活血管平滑肌細胞中 K (ATP)通道及依賴細胞外 Ca2+的內(nèi)流來發(fā)揮作用,而NO和CO則是通過激活環(huán)磷鳥苷 cG MP通路和Ca2+依賴性鉀離子通道發(fā)揮擴血管作用,并抑制平滑肌細胞的增殖。細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)重要的特征之一是不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間通過復(fù)雜的相互作用形成信號網(wǎng)絡(luò),以整合調(diào)控的模式精確調(diào)控細胞活動[19-21]。那么AS時,NOS系統(tǒng),HO系統(tǒng)同時受損,H2S/CES系統(tǒng)起代償作用,而此時運動對兩者的調(diào)節(jié)有何異同;運動時H2S/CES又是通過何種機制影響AS;運動對它的表達又有何影響等,將成為是運動醫(yī)學(xué)的研究熱點,亟待全面而深入地探討,對預(yù)防和治療 AS將有著更為積極意義。

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Effect of the CSE/H2S System of Exercise Intervention on Atherosclerosis of the Experimental SD Rat

L iu Fang
(Physical Education College,SouthwestUniversity,Chongqing 400715)

Objective:To investigate changes in the CSE/H2S system in the process of atherosclerosis aswell as the effect of aerobicson the system.Methods:16 SD ratsof exper imental atherosclerosis are made into models and randomly divided into theM group and the N group,withM group swimming 30 minutes each day for eightweeks on end,while the N group not doing any exercise.At the same time,the control group is fed normally.Then levelsof serum lipids and serum H2S are deter mined by the immunohistochenistry technique.Results:at the end of the eighth week,compared with the control group,the blood fat level significantly increases,while the level of plasma H2S and the expression of CSE decrease in theM and N groups.

atherosclerosis,cystathionine-r-lyase,hydrogen sulphide,aerobics

G804.2

A

1001—9154(2010)03—0073—04

book=73,ebook=94

G804.2

A

1001—9154(2010)03—0073—04

劉芳 (1972—),女,碩士,西南大學(xué)講師,研究方向:體育教學(xué)與訓(xùn)練。

2009—12—10