董 娟,辛 明,趙博生

(山東理工大學生命科學學院,山東 淄博 255049)

促甲狀腺激素受體(the thyrotropin receptor,TSHR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族[1].它與促甲狀腺激素特異性結(jié)合來調(diào)節(jié)甲狀腺細胞的成長、增殖和分化[2],通過第二信使cAMP[3],激活磷脂酶C和蛋白激酶A信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng).近年來研究發(fā)現(xiàn)TSHR除在甲狀腺細胞中表達外,還在淋巴細胞、脂肪細胞、肌纖維細胞表面及生殖腺等[4-5]組織細胞有表達.TSHR胞外域突變,可引發(fā)AITD疾病[6-7].文昌魚屬于脊索動物門頭索亞門,處在無脊椎動物向脊椎動物進化的關(guān)鍵位置,是研究脊索動物演化和胚胎發(fā)育的模式動物,在比較基因組學和發(fā)育同源性研究中有重要作用[8].關(guān)于文昌魚內(nèi)柱和脊椎動物甲狀腺之間的同源性獲得了多方面證據(jù)支持:內(nèi)柱可以同甲狀腺一樣代謝碘產(chǎn)生的碘化甲狀腺氨酸,而且能合成相似的甲狀腺球蛋白和過氧化物酶等[9].

本文通過構(gòu)建文昌魚TSHR基因的原核表達載體,得到融合表達蛋白,為以后研究該蛋白的性質(zhì)、功能、與其相互作用蛋白以及脊椎動物甲狀腺的起源問題提供一定的實驗基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

重組質(zhì)粒pcDNA3-TSH R為本實驗室構(gòu)建;pGEX-4T-1載體購自Promega公司;E.coliDH5α為實驗室保存菌種;T aq聚合酶、BamHI、XhoI、DNA回收純化試劑盒、蛋白分子質(zhì)量標準等均購自TAKARA公司;兔抗人促甲狀腺激素受體蛋白購自北京賽馳生物科技有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 pGEX-4T-1-TSHR重組質(zhì)粒表達體系的構(gòu)建

根據(jù)青島文昌魚TSHR基因,設(shè)計帶有酶切位點的特異性引物,由上海生工生物技術(shù)公司合成.上游引物序列5'CGGGATCCTGCTGCT TACC 3'(下劃線表示BamHI酶切位點),下游引物序列5'CCCTCGAGGGTCAAGTGAACCAGTC 3'(下劃線表示XhoI酶切位點).以pcDNA3-TSHR質(zhì)粒為模板,加入合成的引物進行PCR擴增.用BamHI和XhoI分別對PCR得到的TSHR基因片段與pGEX-4T-1載體進行雙酶切,將酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后,用TAKARA公司DNA回收試劑盒分別回收,T4連接酶16℃連接過夜.連接產(chǎn)物5μ L轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α.將轉(zhuǎn)化后的DH5α涂布于含100 μ g/mL Amp+的LB平板,37℃培養(yǎng)16 h,挑取菌落,提取重組質(zhì)粒,用TSHR基因的特異性引物進行PCR鑒定.并使用BamHI和XhoI進行雙酶切鑒定,將鑒定正確的質(zhì)粒送上海博尚生物公司測序,陽性重組質(zhì)粒命名為pGEX-4T-1-TSHR.

1.2.2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TSH R的誘導表達

含重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TSHR的大腸桿菌DH5α過夜培養(yǎng),以此為種子菌接種在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃,250 r/min振蕩培養(yǎng)至A600接近0.6時,加入1mmol/L IPTG,并在誘導2h、3h、4h、5h時收集菌液1mL,離心收集細菌沉淀,用轉(zhuǎn)化pGEX-4T-1載體的DH5α和未轉(zhuǎn)化載體的DH5α作為對照,進行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析.

1.2.3 Western blot分析

12%的SDS-PAGE凝膠電泳后,轉(zhuǎn)PVDF膜,5%的BSA在37℃封閉2h;PBST室溫洗膜,加入兔抗TSH R多克隆抗體(1:300),于4℃孵育過夜;PBST室溫洗膜,加入辣根過氧化酶標記的羊抗兔二抗(1:1000)37℃1 h,PBST室溫洗膜,加底物DAB顯色.

2 結(jié)果

2.1 TSHR基因的PCR擴增及重組質(zhì)粒鑒定

用PCR基因擴增法得到含有BamHI和XhoI酶切位點的TSHR基因片段,結(jié)果為一條1700 bp左右的條帶,與目的基因大小相符(圖1).通過對轉(zhuǎn)化后篩選得到菌株,提取重組質(zhì)粒,進行PCR擴增得到一條與目的基因的大小一致,約1700 bp大小的條帶(圖2);雙酶切鑒定得到兩條分別為1700 bp和4900 bp的條帶(圖2),分別與目的基因和線性化質(zhì)粒pGEX-4T-1的大小相一致.并且測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進行blast比對,發(fā)現(xiàn)序列完整正確.說明目的基因片斷已成功連接到表達載體上,表達載體構(gòu)建成功.

圖1 PCR得到含有BamHI and XhoI酶切位點的T SHR基因片段

2.2 重組蛋白的表達及鑒定

含有重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TSHR的工程菌經(jīng)1mmol/L IPTG誘導后,經(jīng)SDS-PAGE分析,在76 kDa處有一條條帶,而對照空載體和空菌的誘導在此位置沒有條帶(圖3).根據(jù)DNASTAR軟件模擬分析得出TSHR蛋白分子量約50 kDa,而GST大小約為26kDa,與SDS-PAGE分析的大小一致.說明在大腸桿菌DH5α中表達了融合蛋白.Western blot證實,表達蛋白即為目的蛋白(圖4).

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TSHR的酶切鑒定及PCR鑒定

圖3 重組蛋白表達的SDS-PAGE分析

圖4 Western blot檢測目的基因表達

3 討論

本實驗通過將PCR擴增得到的TSHR基因片段,連接到pGEX-4T-1,轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α中,構(gòu)建了青島文昌魚pGEX-4T-1-TSHR融合表達載體.重組質(zhì)粒進行PCR、雙酶切及測序檢測,表明青島文昌魚TSHR基因準確插入pGEX-4T-1表達載體中.以時間為梯度,1mM IPTG誘導大腸桿菌的表達,發(fā)現(xiàn)4 h,5 h時表達量比較多.但是因為此蛋白是膜蛋白而且是激素類受體,所以總體來說表達量不是很大.用抗促甲狀腺激素受體多克隆抗體進行Western blot檢測,結(jié)果顯示表達蛋白是TSHR蛋白.

促甲狀腺激素受體在脊椎動物下丘腦—垂體—甲狀腺調(diào)控軸中發(fā)揮著重要作用,被認為是甲狀腺的一個特殊的蛋白.它的突變能引起一些重要的疾病,如甲狀腺功能低下、甲狀腺瘤、Graves眼病等.目前在脊椎動物中對其研究主要集中在疾病研究中.一些研究表明文昌魚內(nèi)柱和脊椎動物甲狀腺具有同源性.

本實驗成功表達了該蛋白,為后續(xù)研究該蛋白結(jié)構(gòu)和生物功能,以及與其相互作用蛋白的研究奠定了基礎(chǔ),同時,鑒于文昌魚的特殊進化地位,對于闡釋TSH R蛋白的起源與進化,以及進一步探索其具體的分子機理都具有重要的理論和實踐意義.

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