錢益平，王 琪，曹小燕，周 波

蘭州大學功能有機分子化學國家重點實驗室，甘肅蘭州 730000

咖啡酸苯乙酯衍生物抑制紅細胞溶血和HL-60細胞增殖活性的構效關系研究

錢益平，王 琪，曹小燕，周 波

蘭州大學功能有機分子化學國家重點實驗室，甘肅蘭州 730000

蜂膠中的主要成分咖啡酸苯乙酯作為重要的抗氧化劑和癌預防試劑分子，引起了人們相當?shù)呐d趣。為了研究其構效關系，作者通過?；磻铣闪?個咖啡酸苯乙酯衍生物，即：咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester，CAPE）、 芥子酸苯乙酯（sinapic acid phenethyl ester，SAPE）、阿魏酸苯乙酯（ferulic acid phenethyl ester，F(xiàn)APE）、4-羥基肉桂酸苯乙酯（4-hydroxycinnamic acid phenethyl ester，4-HCAPE）、3,5-二羥基肉桂酸苯乙酯（3,5-dihydroxycinnamic acid phenethyl ester，3,5-DHCAPE） 和3-羥基肉桂酸苯乙酯（3-hydroxycinnamic acid phenethyl este，3-HCAPE）。以水溶性偶氮引發(fā)劑2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽誘導的紅細胞溶血為模型，研究了它們的抗氧化活性。根據(jù)實驗測得的有效抑制溶血時間，其活性順序為：CAPE≈4-HCAPE＞SAPE＞FAPE＞3,5-DHCAPE＞3-HCAPE。其活性顯著依賴于化合物的結構（羥基的數(shù)目和位置）和親酯性。具有鄰二羥基結構的CAPE和4位羥基取代的4-HCAPE具有最高的抗氧化活性。此外，它們抑制人早幼粒白血病細胞株HL-60增殖活性也通過噻唑藍的方法評價。有趣的是，CAPE和4-HCAPE也同樣具有抑制HL-60細胞增殖活性的最好能力。這些結果提供了一種基于生物抗氧化劑的癌預防藥物分子設計思路。

咖啡酸苯乙酯；抗氧化劑；構效關系；紅細胞；癌預防試劑

0 引 言

體內(nèi)自由基的過量產(chǎn)生（氧化應激，Oxidative stress）可以引起細胞膜脂質、DNA和蛋白質分子的氧化性損傷，導致癌癥[1,2]、衰老[3]和神經(jīng)退行性疾病[4]。大量的流行病學證據(jù)表明，果蔬類和飲料等食品的攝入能降低許多慢性疾病，特別是癌癥的發(fā)生率[5～10]。按照自由基生物學和醫(yī)學的理論，這是因為果蔬類和飲料等食品中富含的生物抗氧化劑能夠清除過量產(chǎn)生的自由基，抑制和修復自由基對細胞膜脂質、DNA和蛋白質分子的氧化性損傷，維持體內(nèi)的氧化還原平衡，因此可預防和治療這些疾病[11]。

享有“紫色黃金”美譽的食品——蜂膠，是蜜蜂采集植物樹脂經(jīng)過咀嚼加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物，含有數(shù)百種化學成分。其中咖啡酸苯乙酯（caffeic acidphenethyl ester，CAPE）是蜂膠中的主要活性成分，在抗腫瘤[12]、抗氧化[13]、抗炎癥[14]和免疫調節(jié)[15]等方面具有重要的生物活性。它作為抗氧化藥物和癌預防藥物研究的明星分子，受到了人們極大的關注[12,13,16～19]。為了評價CAPE在抗氧化和癌預防活性方面的構效關系，并作為系統(tǒng)研究生物抗氧化劑作用機制的一部分[20～24]，我們通過?；磻铣闪?個咖啡酸苯乙酯衍生物，即：咖啡酸苯乙酯（CAPE）、阿魏酸苯乙酯（ferulic acid phenethyl ester,FAPE）、4-羥基肉桂酸苯乙酯（4-hydroxycinnamic acid phenethyl ester，4-HCAPE）、芥子酸苯乙酯（sinapic acid phenethyl ester，SAPE）、3,5-二羥基肉桂酸苯乙酯（3,5-dihydroxycinnamicacidphenethylester，3,5-DHCAPE）和 3-羥基肉桂酸苯乙酯（3-hydroxycinnamic acid phenethyl ester，3-HCAPE）（圖 1）。

紅細胞膜富含不飽和脂肪酸，這些不飽和脂肪酸對自由基誘導的脂質過氧化非常敏感，最終導致溶血的發(fā)生。此外，紅細胞膜是一種異相介質和簡單的代謝模型，通常被用于評價具有不同親酯能力的抗氧化劑分子的活性[25]。因此，本文采用水溶性的偶氮化合物2,2′-偶氮二（2-脒基丙烷)二鹽酸鹽（2,2′-azobis(2-amidinopropane)hydrochloride，AAPH)作為自由基引發(fā)劑，以其在生理溫度下誘導的紅細胞溶血為模型，評價6個咖啡酸苯乙酯衍生物的抗氧化活性。同時，它們抑制人早幼粒白血病細胞株HL-60增殖活性的能力也通過噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)的方法評價[26]。

1 材料與方法

1.1 材料

咖啡酸苯乙酯衍生物按文獻[13,14]報道的方法合成。首先將自制的酚酸（1 mmol）與過量的 SOCl2（3 equiv）在無水1,4-二氧六環(huán)溶液（10 ml）中回流3～4 h，使酚酸轉化成酰氯，再在室溫下滴加苯乙醇（2 mmol），繼續(xù)回流3～4 h。反應進程通過薄層層析（thin-layer chromatography，TLC）監(jiān)測。反應完全后，減壓除去溶劑，殘留物通過硅膠色譜柱分離。得到的咖啡酸苯乙酯及其類似物的結構和純度分別經(jīng)1H、13C NMR和HPLC鑒定，其結構如圖1所示。AAPH和MTT購自Sigma-Aldrich公司，直接使用。RPMI 1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司，小牛血清購自杭州四季青公司，人早幼粒白血病細胞株HL-60購自中科院上海生物化學與細胞生物學研究所。

1.2 人紅細胞的分離

人紅細胞懸浮液購自甘肅省中心血站。首先，將懸浮的紅細胞2,000 r/min離心10 min，除去上層溶液和黃色的血沉淀，加入含有137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、8.1 mmol/L Na2HPO4·12H2O和1.5 mmol/L KH2PO4的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4），以2,000 r/min離心10 min，重復洗滌3次，最后一次洗滌時嚴格控制離心機的轉速為2,000 r/min以得到相同緊密度的紅細胞。

1.3 抑制AAPH誘導的紅細胞溶血測定

將紅細胞加入pH=7.4的PBS中配成濃度為5%的紅細胞懸浮液,于37℃溫育5 min，然后加入50 mmol/L AAPH水溶液引發(fā)溶血，溫育期間反應混合液在水浴搖床上輕輕搖動。溶血程度按文獻[23]的方法通過分光光度法測定。在適當?shù)臅r間間隔取出適量的反應混合液，用0.15 mol/L NaCl稀釋，以2,000 r/min的轉速離心10 min將紅細胞分離，取上層清液在紫外可見分光光度計上、波長540 nm處測其吸光值A；同樣地，取出適量的反應混合液，用蒸餾水稀釋，使紅細胞完全溶血，同樣條件下離心后在540 nm處測其吸光值B；百分溶血度等于(A/B)×100。在抗氧化實驗中抗氧化劑咖啡酸苯乙酯衍生物通過二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）引入，在AAPH加入以前先行加入并且溫育。每次實驗至少重復3次，實驗誤差在10%以內(nèi)。

1.4 抑制HL-60細胞增殖活性

將HL-60細胞用RPM11640培養(yǎng)基 〔含10% 滅活小牛血清（FCS），2 mmol/L谷氨酞胺，100 IU/L青霉素和鏈霉素〕在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的HL-60細胞，以5×104個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔90 μl，然后加入10 μl不同濃度的藥物，濃度平行三個孔（總體積100 μl）。藥物通過DMSO溶解引入（DMSO終濃度小于0.1%）。培養(yǎng)48 h之后，每孔加10 μl的MTT溶液（5 mg/mL在PBS中），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，培養(yǎng)板以1200×g離心15 min。棄上清，加150 μl DMSO，震蕩10 min后在酶聯(lián)免疫測定儀（Bio-Rad 550，USA）490 nm處測定光密度（OD）。細胞存活率按以下公式計算：存活率(%)=(空白對照OD-藥物組OD)/空白對照OD×100。

1.5 CLogP的計算

咖啡酸苯乙酯衍生物在辛醇-水中的分配系數(shù)（Coefficient LogP，CLogP）使用Bio-Loom軟件（Biobyte Corp.version 5）計算[27,28]。

2 結果與討論

2.1 咖啡酸苯乙酯衍生物抑制AAPH誘導的紅細胞氧化性溶血

圖2所示為在空氣中AAPH誘導的紅細胞溶血及CAPE的抗溶血活性。在不加AAPH的情況下，紅細胞是穩(wěn)定的，4 h之內(nèi)基本沒有溶血發(fā)生（圖2，a線）。加入50 mmol/L AAPH，經(jīng)過一定的抑制期（100 min）后，紅細胞才開始快速溶血（圖2，b線）。這個抑制期應該是由紅細胞本身所含有的內(nèi)源性生物抗氧化劑，如維生素E和泛氫醌-10[20]所造成的。將CAPE加入到紅細胞中會明顯增加紅細胞的固有抑制期（tinh）。 其抑制期依賴于CAPE的濃度（圖2）。如使用10 μmol/L的CAPE時，測得的抑制期分別為192 min（圖2，e線），即它使紅細胞固有的抑制期延長了92 min（有效抑制溶血時間，teff）。圖3顯示了10 μmol/L的咖啡酸苯乙酯衍生物抑制紅細胞溶血的作用。其teff顯著依賴于化合物的結構。根據(jù)teff（表1），抗溶血活性的順序為CAPE≈4-HCAPE＞SAPE＞FAPE＞3,5-DHCAPE＞3-HCAPE。值的注意的是，盡管4-OH的衍生物（4-HCAPE）產(chǎn)生的teff與CAPE類似，但其抑制期后的紅細胞溶血速率比CAPE快（圖3中的b和c線）。這證實了CAPE在所有化合物中是活性最高的。另一方面，CAPE抑制溶血的速率在抑制期后要比紅細胞本身的溶血速率慢得多，暗示著CAPE的氧化產(chǎn)物也具有抗氧化作用。

表1 咖啡酸苯乙酯衍生物的抗溶血活性和抑制HL-60細胞增殖活性Table 1 Anti-haemolysis activity and antiproliferative activity against HL-60 cells of caffeic acid phenethyl ester derivatives(ArOHs)

從上述實驗結果可知，具有鄰二羥基和鄰羥基甲氧基結構的CAPE、SAPE和FAPE顯示出比3,5-DHCAPE和3-HCAPE更強的抗氧化活性。眾所皆知，酚類化合物的抗氧化活性取決于羥基中O-H鍵的鍵能[29]。因此，它們活性較好的原因應為在4-OH鄰位引入推電子基團-OH和-OCH3，從而降低O-H鍵的鍵能[29]。這一結論已被光譜測定[30]和理論計算[29]所證實。理論計算表明：鄰羥基酚氧自由基的O-H鍵鍵能比其母體分子鄰苯二酚強4 kcal/mol，而鄰苯二酚的O-H鍵能比苯酚和間苯二酚分別低9.1和8.8 kcal/mol[29]。此外，鄰羥基酚氧自由基很容易進一步氧化生成鄰醌[24]。類似的鄰二羥基和鄰羥基甲氧基結構在抗氧化活性中的重要性在黃酮醇[21]、姜黃素[22]和白藜蘆醇類似物[24]中也被證實。值得注意的是，盡管4-HCAPE的O-H鍵能高于SAPE和FAPE的O-H鍵能[29]，但其活性優(yōu)于鄰羥基甲氧基結構的SAPE和FAPE，這暗示著化合物的親脂性可能是影響抗氧化劑活性的另一個重要因素。在異相介質紅細胞中，親脂性體現(xiàn)了化合物穿透膜的能力，從而有利于捕獲鏈增長自由基和延長化合物的teff。因此我們使用Bio-Loom軟件[27,28]計算了這些化合物在辛醇-水中的分配系數(shù)CLogP（表1）。結果顯示：4-HCAPE和3-HCAPE具有最高的親脂性（CLogP=3.9）。因此，4-HCAPE強的抗氧化活性可能與其高的親脂能力相關。盡管3-HCAPE也具有高的親脂能力，但在紅細胞溶血實驗中呈現(xiàn)較弱的抗氧化活性，這可能是由于其3-OH鍵能高于4-HCAPE中的4-OH鍵能。以上結果證實：在異相介質紅細胞中，O-H鍵能和親脂性是影響化合物抗氧化活性的重要因素。

2.2 咖啡酸苯乙酯衍生物抑制HL-60細胞增殖活性

進一步地，咖啡酸苯乙酯衍生物抑制HL-60細胞增殖活性也通過MTT的方法測定。結果采用抑制HL-60細胞增殖50%所需化合物的濃度（IC50）值表示（表1）。其中，CAPE的IC50值為14.6 μmol/L，活性最高。根據(jù)IC50值，它們的活性順序為CAPE＞4-HCAPE＞SAPE≈FAPE≈3,5-DHCAPE＞3-HCAPE。這個活性順序類似于溶血中的活性順序。有趣的是，在溶血試驗中具有最高抗氧化活性的CAPE和4-HCAPE，也同樣具有最好的抑制HL-60細胞增殖活性。這種相關性也暗示著簡單的紅細胞溶血模型的重要性，以及一種基于抗氧化劑的癌預防藥物分子設計策略。

3 結 論

總之，我們合成了6個具有不同結構的咖啡酸苯乙酯衍生物，并且評價了它們的抗氧化和抗增殖活性。在兩個實驗中，CAPE和4-HCAPE均呈現(xiàn)最好的活性。此外，抗氧化活性和抗增殖活性的相關性也給我們提供了一種從抗氧化劑的角度設計癌預防藥物分子的思路。

1.PerwezHS，Hofseth LJ，HarrisCC. Radical cause of cancer.Nat Rev Cancer,2003,3：276～285

2.Klaunig JE,Kamendulis LM.The role of oxidative stress in carcinogenesis.Annu Rev Pharmacol Toxicol,2004,44：239～267

3. Finkel T,Holbrook NJ.Oxidants,oxidative stress and the biology of ageing.Nature,2000,408：239-247

4. Kevin JB,Colin L,Ashley IB.Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Nat Rev Drug Discov，2004，3：205～214

5. Chung SY,Xin W,Gang L,Sonia CP.Cancer prevention by tea：animal studies,molecular mechanisms and human relevance.Nat Rev Cancer,2009,9：429～439

6. Alan C，Jaganath IB，Clifford MN. Dietary phenolics：chemistry,bioavailability and effects on health.Nat Prod Rep,2009,26：1001～1043

7. Pan MH，Ho CT. Chemopreventive effects of natural dietary compoundson cancerdevelopment. Chem Soc Rev,2008,37：2558～2574

8.Pan MH,Ghai G,Ho CT.Food bioactives,apoptosis,and cancer.Mol Nutr Food Res,2008,52：43～52

9. Sonia R. Cancerchemoprevention and chemotherapy：dietary polyphenols and signalling pathways.Mol Nutr Food Res,2008,52：507～526

10.Milner JA.Nutrition and cancer：essential elements for a roadmap.Cancer Lett,2008,269：189～198

11.Rice-Evans CA,Diplock AT.Current status of antioxidant therapy.Free Radic Biol Med,1993,15：77～96

12.Watabe M,Hishikawa K,Takayanagi A,Shimizu N,Nakaki T. Caffeic acid phenethylesterinduces apoptosis by inhibition of NF-κB and activation of Fas in human breast cancer MCF-7 cells.J Biol Chem,2004,279：6017～6026

13.Jayaprakasam B,Vanisree M,Zhang Y,Dewitt DL,Nair MG.Impact of alkyl esters of caffeic and ferulic acids on tumor cell proliferation,cyclooxygenase enzyme,and lipid peroxidation.J Agric Food Chem,2006,54：5375～5381

14.Uwai K,Osanai Y,Imaizumi T,Kanno SI,Takeshita M,Ishikawa M. Inhibitory effect of the alkyl side chain of caffeic acid analogues on lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in RAW264.7 macrophages.Bioorg Med Chem,2008,16：7795～7803

15. NatarajanK，Singh S，Burhe Jr TR，Grunberger D,Aggarwal BB.Caffeic acid phenethyl ester is a potent and specific inhibitor of activation of nuclear transcription factor NκB.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93：9090-9095

16.Huang MT,Ma W,Yen P,Xie JG,Han Jk,Frenkel K,Grunberger D,Conney AH.Inhibitory effects of caffeic acid phenethyl ester(CAPE) on 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced tumor promotion in mouse skin and the synthesis ofDNA，RNA and protein in HeLa cells.Carcinogenesis,1996,17：761～765

17.Weyant MJ,Carothers AM,Bertagnolli ME,Bertagnolli MM.Colon cancerchemopreventive drugs modulate integrinmediated signaling pathways.Clin Cancer Res,2000,6：949～956

18.Chung TW,Moon SK,Chang YC,Ko JH,Lee YC,Cho G,Kim SH,Kim JG,Kim CH.Novel and therapeutic effect caffeic acid and caffeic acid phenyl ester on hepatocarcinoma cells：complete regression of hepatoma growth and metastasisby dual mechanism. FASEB J,2004,18：1670～1681

19.Jung JE,Kim HS,Lee CS,Park DaH,Kim YN,Lee MJ,Lee JW,Park JW,Kim MS,Ye SK,Chung MH.Caffeic acid and itssynthetic derivative CADPE suppresstumor angiogenesis by blocking STAT3-mediated VEGF expression in human renal carcinoma cells.Carcinogenesis,2007,28：1780～1787

20.Deng SL,Chen WF,Zhou B,Yang L,Liu ZL.Protective effects of curcumin and its analogues against free radical-induced oxidativehaemolysisof human red blood cells.Food Chem,2006,98：112～119

21.Zhou B,Miao Q,Yang L,Liu ZL.Antioxidative effects offlavonols and their glycosides against the free-radicalinduced peroxidation of linoleic acid in solution and in micelles.Chem Eur J,2005,11：680～691

22.Chen WF,Deng SL,Zhou B,Yang L,Liu ZL.Curcumin and its analogues as potentinhibitors oflow density lipoprotein oxidation：H-atom abstraction from the phenolic groups and possible involvement of the 4-hydroxy-3-methoxyphenyl groups.Free Radic Biol Med,2006,40：526～535

23.Shang YJ,Jin XL,Shang XL,Tang JJ,Liu GY,Dai F,Qian YP,Fan GJ,Liu Q,Zhou B.Antioxidant capacity of curcumin-directed analogues：structure-activity relationship and influence of microenvironment.Food Chem,2010,119：1435～1442

24.Shang YJ,Qian YP,Liu XD,Dai F,Shang XL,Jia WQ,Liu Q,Fang JG,Zhou B.Radical-scavenging activity and mechanism of resveratrol-oriented analogues：influence of the solvent,radical and substitution.J Org Chem,2009,74：5025～5031

25.Paiva-Martins F,Fernandes J,Rocha S,Nascimento H,Vitorino R,Amado F,Borges F,Belo L,Santos-Silva A.Effects of olive oil polyphenols on erythrocyte oxidative damage.Mol Nutr Food Res,2009,53：609～616

26.Hussain RF,Nourin AME,Oliver RTD.A new approach for measurement of cytotoxicity using colorimetric assay.Journal of Immunological Methods,1993,160：89～96

27.HanschC,LeoA.ExploringQSAR：fundamentsand applicationsin chemistry and biology. Washington，DC：American Chemical Society,1995

28.Selassie CD,Kapur,S,Verma RP,Rosario M.Cellular apoptosis and cytotoxicity of phenolic compounds： a quantitative structure-activity relationship study. J Med Chem,2005,48：7234～7242

29.Wright JS,Johnson ER,Dilabio GA.Predicting the activity of phenolic antioxidants：theoretical method，analysis of substituent effects，and application to major families of antioxidant.J Am Chem Soc,2001,123：1173～1183

30.Foti M,Ruberto G.Kinetic solvent effectson phenolic antioxidant determined by spectrophotometric measurements.J Agric Food Chem,2001,49：342～348

This work was supported by a grant from The National Natural Science Foundation of China(120972063)

Structure-Activity Relationship for Anti-Haemolysis and Cytotoxicity Against HL-60 Cells of Caffeic Acid Phenethyl Ester Derivatives

QIAN Yiping,WANG Qi,CAO Xiaoyan,ZHOU Bo
State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China

Mar 18,2010 Accepted：Apr 13,2010

Zhou Bo,Tel：+86(931)8912500,E-mail：bozhou@lzu.edu.cn

Caffeic acid phenethyl ester hasbeen identified asan active component of propolis,and its antioxidant and cancer chemoprevention activities have attracted considerable attention.In order to reveal the structure-activity relationship of caffeic acid phenethyl ester derivatives(ArOHs),the authors synthesized six ArOHs,caffeic acid phenethyl ester(CAPE),ferulic acid phenethyl ester(FAPE),4-hydroxycinnamic acid phenethyl ester(4-HCAPE),sinapic acid phenethyl ester(SAPE),3,5-dihydroxycinnamic acid phenethyl ester(3,5-DHCAPE) and 3-hydroxycinnamic acid phenethyl ester(3-HCAPE) by preparing acyl chlorides of cinnamic acid followed by alkoxy-dehalogenation.The antioxidant capacity of theArOHsagainst AAPH-induced oxidative haemolysis of red blood cells was examined.It was found that the antioxidant activity depended significantly on molecular structure(position and number of hydroxyl groups)and lipophilicity in the order of CAPE≈4-HCAPE＞SAPE＞FAPE＞3,5-DHCAPE＞3-HCAPE.Compounds bearing o-dihydroxyl groups and 4-hydroxyl group on the aromatic ring(CAPE and 4-HCAPE)were the most active.Furthermore,their antiproliferative effect on human promyelocyticleukemia (HL-60) cellswas assessed by MTT method.Intriguingly,compounds with higher antioxidant activity(CAPE and 4-HCAPE)exhibited higher antiproliferative activity,which reinforces the idea of designing antioxidant-based cancer chemoprevention agents.

Caffeic acid phenethyl ester;Antioxidant;Structure-activity relationship;Red blood cell;Cancer chemoprevention

2010-03-18；接受日期：2010-04-13

國家自然科學基金面上項目(20972063)

周波，電話：(0931)8912500，E-mail：bozhou@lzu.edu.cn

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