楊彩玉，安希文，付 偉，王 婷,

安曉晶1，王振華1，鄭秋生1

1.石河子大學(xué)藥學(xué)院新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832002；

2.河北省故城縣中醫(yī)院，河北鄭口 253800

香青蘭總黃酮對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈的舒張作用

楊彩玉1，安希文2，付 偉1，王 婷1,

安曉晶1，王振華1，鄭秋生1

1.石河子大學(xué)藥學(xué)院新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832002；

2.河北省故城縣中醫(yī)院，河北鄭口 253800

香青蘭（Dracocephalum Moldavica L.）為傳統(tǒng)維吾爾族藥材，具有補(bǔ)益心腦之功效，現(xiàn)代研究表明其對(duì)冠心病、心絞痛等病具有治療作用。該文作者采用大鼠離體胸主動(dòng)脈灌流技術(shù)，觀察了香青蘭總黃酮的血管舒張作用，旨在為闡明其活性物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供依據(jù)。結(jié)果表明：1）10.0～40.0 mg/L香青蘭總黃酮對(duì)內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮大鼠主動(dòng)脈環(huán)的基礎(chǔ)張力沒有明顯影響。2）10.0～40.0 mg/L香青蘭總黃酮對(duì)去甲腎上腺素（NE，10 μmol/L）所致的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管均有濃度依賴性的舒張作用，對(duì)內(nèi)皮完整血管的舒張作用更強(qiáng)；一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯L-NAME（0.1 mmol/L）、鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍(lán)（10 μmol/L）和環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛（10 μmol/L）預(yù)處理均可一定程度上抑制香青蘭總黃酮的血管舒張作用，表明血管內(nèi)皮合成的一氧化氮（NO）信號(hào)通路和前列環(huán)素（PGI2）信號(hào)通路參與了香青蘭總黃酮的血管舒張作用。3）香青蘭總黃酮預(yù)處理去內(nèi)皮血管環(huán)可以抑制細(xì)胞外鈣內(nèi)流所致的血管收縮，但對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放所致的血管收縮沒有影響，香青蘭總黃酮對(duì)高鉀（60 mmol/L KCl）所致血管收縮沒有明顯影響，表明香青蘭總黃酮可抑制血管平滑肌細(xì)胞的受體依賴性鈣通道，阻止細(xì)胞外鈣內(nèi)流，從而可舒張血管。上述結(jié)果表明，香青蘭總黃酮一方面可通過活化內(nèi)皮依賴性的NO和PGI2通路舒張血管，另一方面通過抑制血管平滑肌細(xì)胞膜上受體依賴性鈣通道產(chǎn)生血管舒張作用。香青蘭總黃酮多靶點(diǎn)的擴(kuò)血管作用可能是香青蘭治療心臟病的機(jī)制之一。

香青蘭；總黃酮；血管舒張；鈣通道；血管內(nèi)皮

0 引 言

香青蘭（Dracocephalum Moldavica L.）為唇形科一年生草本植物，其干燥地上部分是維吾爾民族習(xí)用藥材，名為巴迪然吉布亞，《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾標(biāo)準(zhǔn)（1999年版）》收載了其單方提取物制備的制劑“益心巴迪然吉布亞顆?！?，其具有“補(bǔ)益心腦、利尿、止喘”的功效，“用于神疲失眠、心煩氣喘、神經(jīng)衰弱”等癥的治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，香青蘭對(duì)異丙腎上腺素誘發(fā)的小鼠心肌缺血損傷有保護(hù)作用[1]，臨床研究也表明，香青蘭對(duì)冠心病、心絞痛有一定治療作用，且具有降低膽固醇、改善血脂異常的作用[2]。目前，香青蘭藥理活性的作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)仍不清楚，本研究觀察了香青蘭總黃酮對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)環(huán)舒張功能，并探討了其作用機(jī)制，旨在為香青蘭的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥材與試劑

香青蘭購自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)鑒定為香青蘭（Dracocephalum Moldavica L.）地上部分。按文獻(xiàn)所述方法[3]制備香青蘭總黃酮（DTF），比色法測(cè)定其純度為87.4%。

左旋硝基精氨酸甲酯 〔N(omega)-nitro-L-arginine-methyl-ester，L-NAME〕、亞甲藍(lán)（Methyleneblue）、吲哚美辛（Indomethacine）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）均為Sigma公司產(chǎn)品。其余試劑為國產(chǎn)市售分析純。本研究所用試劑均以Millipore Milli-Q超純水配制。

K-H 液（mmol/L）：NaCl 118.0，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，NaHCO325.0，glucose 5.5，CaCl22.5。臨用前配制，0.22 μm除菌濾膜過濾后使用。

1.2 大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的準(zhǔn)備

方法如文獻(xiàn)[4]所述。實(shí)驗(yàn)用雄性SD大鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：SCKX新2003-009），體重250～300 g，10%水合氯醛（350 mg/kg，ip）麻醉后，迅速游離胸主動(dòng)脈,置于通以95%O2+5%CO2混合氣體的4℃ K-H液中，剔除周圍組織，將血管條剪成約3～4 mm寬的血管環(huán)，避免過度牽拉以損傷內(nèi)皮。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用棉簽?zāi)ゲ裂墉h(huán)內(nèi)表面，以去除內(nèi)皮細(xì)胞。將血管環(huán)一端固定，一端連接張力換能器，放入含K-H液的浴槽內(nèi)，持續(xù)通以95%O2+5%CO2的混合氣體，將靜息張力調(diào)至2.0 g，使用BIOPAC（MP150型，USA）多道生理記錄儀記錄血管環(huán)的張力變化。在37℃下穩(wěn)定90 min，期間每20 min換液一次。

用KCl（60 mmol/L）重復(fù)刺激3次，以誘發(fā)血管的最大收縮幅度。用ACh檢驗(yàn)血管內(nèi)皮活性，待動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定后，換液一次，浴槽中加入10 μmol/L去甲腎上腺素（NE），收縮達(dá)峰值15 min后，加入10 μmol/L Ach檢驗(yàn)血管內(nèi)皮完整程度（預(yù)收縮的血管舒張程度大于90%，可認(rèn)為內(nèi)皮完整，舒張程度小于10%則認(rèn)為去除內(nèi)皮成功）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

血管環(huán)基礎(chǔ)張力的測(cè)定方法如文獻(xiàn)所述[4]。

香青蘭總黃酮對(duì)血管環(huán)基礎(chǔ)張力的影響：當(dāng)內(nèi)皮完整或去除內(nèi)皮的血管環(huán)在靜息狀態(tài)下穩(wěn)定后，采用累積加藥方法，每隔10 min加入香青蘭總黃酮（10 mg/mL，預(yù)先溶于K-H液），使灌流液中香青蘭總黃酮濃度分別達(dá)10、20、30、40 mg/L，記錄血管環(huán)張力變化，對(duì)照組加入等體積K-H液代替香青蘭總黃酮。

香青蘭總黃酮對(duì)KCl、NE預(yù)收縮的血管環(huán)張力的影響：當(dāng)內(nèi)皮完整或去除內(nèi)皮的血管環(huán)達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，分別用KCl（60 mmol/L）或NE（10 μmol/L）預(yù)收縮血管達(dá)穩(wěn)態(tài)后，按上述累積加藥方法，觀察香青蘭總黃酮對(duì)KCl或NE預(yù)收縮內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮血管環(huán)張力的影響，對(duì)照組加入等體積K-H液代替香青蘭總黃酮。

L-NAME、亞甲藍(lán)和吲哚美辛對(duì)香青蘭總黃酮作用的影響：內(nèi)皮完整的血管環(huán)分別用0.1 mmol/L L-NAME、10 μmol/L亞甲藍(lán)預(yù)處理15 min，10 μmol/L吲哚美辛預(yù)處理20 min，再加入NE(10 μmol/L)預(yù)收縮血管達(dá)穩(wěn)態(tài)后，按上述累積加藥方法觀察香青蘭總黃酮對(duì)血管張力的影響，對(duì)照組加入等體積K-H液代替香青蘭總黃酮。

香青蘭總黃酮對(duì)外Ca2+內(nèi)流引起血管收縮的影響：按文獻(xiàn)[5]方法使去內(nèi)皮血管環(huán)穩(wěn)定后，換成無鈣K-H溶液穩(wěn)定10 min，加入NE(10 μmol/L)孵浴20 min，加入40 mg/L的香青蘭總黃酮孵育10 min(對(duì)照組加入等體積K-H液代替香青蘭總黃酮)，然后逐步加入CaCl2至3 mmol/L，觀察香青蘭總黃酮預(yù)處理對(duì)血管環(huán)張力變化的影響。

香青蘭總黃酮對(duì)內(nèi)Ca2+釋放引起血管收縮的影響：按文獻(xiàn)[5]方法使去內(nèi)皮血管環(huán)穩(wěn)定后，用K-H溶液孵浴血管環(huán)40 min，換無鈣K-H液繼續(xù)孵浴15 min，加入NE至終濃度為10 μmol/L，使血管收縮，記錄最大張力變化幅度值作為相收縮幅度1(Con1)。待收縮穩(wěn)定后換用含鈣K-H液孵浴40 min，其間更換K-H液3次，至血管條達(dá)基礎(chǔ)張力，再換無鈣K-H液孵浴5 min，更換新的無鈣K-H液后加入香青蘭總黃酮 (至終濃度為40 mg/L)孵浴10 min(對(duì)照組加入等體積K-H液代替香青蘭總黃酮)，加入NE(至終濃度為10 μmol/L)收縮血管，記錄最大張力變化幅度作為相收縮幅度2(Con2)。以香青蘭總黃酮處理組與對(duì)照組間Con2/Con1×100%的差別，反映香青蘭總黃酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放引起血管收縮的影響。

1.4 結(jié)果與統(tǒng)計(jì)分析

上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)8次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以NE(10 μmol/L)或KCl(60 mmol/L)誘發(fā)的最大收縮幅度為100%，藥物處理后的血管張力幅度變化以其百分率表示。所有數(shù)據(jù)均以mean±SD表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，以ANOVA中t檢驗(yàn) (Newman-Keuls法)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 香青蘭總黃酮對(duì)血管基礎(chǔ)張力的影響

與空白對(duì)照組比較，香青蘭總黃酮濃度累加至40 mg/L，對(duì)內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)張力未見明顯影響 (P＞0.05，圖1)，表明香青蘭總黃酮不影響血管本身基礎(chǔ)張力。

圖1 香青蘭總黃酮對(duì)血管基礎(chǔ)張力的影響(A)內(nèi)皮完整血管環(huán)；(B)去內(nèi)皮血管環(huán)Fig.1 Effectoftotalflavonoids from Dracocephalum moldavicaL.(DTF)on basic tension of endothelium-intact or denuded aortic rings (A)With endothelium;(B)Without endothelium

2.2 香青蘭總黃酮對(duì)KCl預(yù)收縮血管張力的影響

與空白對(duì)照組比較，香青蘭總黃酮濃度累加至40 mg/L，對(duì)KCl(60 mmol/L)預(yù)收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)張力未見明顯影響 (P＞0.05，圖2)，表明香青蘭總黃酮對(duì)電壓依賴性鈣通道開放所致細(xì)胞內(nèi)鈣釋放引起的血管收縮沒有影響。

圖2 香青蘭總黃酮對(duì)KCl(60 mmol/L)預(yù)收縮血管張力的影響 (A)內(nèi)皮完整血管環(huán)；(B)去內(nèi)皮血管環(huán)Fig.2 Effect of total flavonoids from Dracocephalum moldavicaL.(DTF)on KCl(60 mmol/L)precontracted rat aortic rings (A) With endothelium;(B)Without endothelium

2.3 香青蘭總黃酮對(duì)去甲腎上腺素預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響

NE(10 μmol/L)可使內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)收縮，香青蘭總黃酮可濃度依賴性地使NE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整主動(dòng)脈血管環(huán)顯著舒張，香青蘭總黃酮也可濃度依賴性地使NE預(yù)收縮的去內(nèi)皮血管舒張，但作用強(qiáng)度不及內(nèi)皮完整的血管環(huán) (圖3)。表明香青蘭總黃酮誘導(dǎo)的血管舒張更大程度上依賴于血管內(nèi)皮的完整性。

圖3 香青蘭總黃酮(DTF)對(duì)去甲腎上腺素(10－5mol/L)預(yù)收縮血管環(huán)張力的影響 ＋E代表內(nèi)皮完整血管環(huán)；－E代表無內(nèi)皮血管環(huán).#P＜0.05,##P＜0.01 vs對(duì)照組;**P＜0.01 vs DTF處理去內(nèi)皮組Fig.3 Vasodilative effectof total flavonoids fromDracocephalum moldavicaL.(DTF)on norepinephrine(NE,10－5mol/L)precontracted rat aortic rings ＋E means in aortic rings with endothelium;－E means in aortic rings without endothelium.#P＜0.05，##P＜0.01 vscontrol group;**P＜0.01 vs DTF treated(－E)group

2.4 L-NAME、亞甲藍(lán)和吲哚美辛對(duì)香青蘭總黃酮舒張血管作用的影響

采用一氧化氮合酶（NOS）抑制劑L-NAME（0.1 mmol/L）、鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍(lán)（10 μmol/L）和環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛（10 μmol/L）預(yù)處理內(nèi)皮完整血管環(huán)，均可一定程度上抑制香青蘭總黃酮所致的NE預(yù)收縮血管舒張，但均未能完全抑制香青蘭總黃酮所致血管舒張（圖4），表明香青蘭總黃酮可通過活化內(nèi)皮依賴性的NO和PGI2通路舒張血管。

圖4 L-NAME(10－4mol/L)、亞甲藍(lán)(10－5mol/L)和吲哚美辛(10－5mol/L)對(duì)香青蘭總黃酮(DTF)舒張血管作用的影響##P＜0.01 vs對(duì)照組;**P＜0.01 vs DTF處理組Fig.4 Effects of NG-nitro-L-arginine methylester(L-NAME) (10－4mol/L),methylene blue (10－5mol/L) and indometacin (10－5mol/L) pretreatmenton vasodilative efficacy of total flavonoids from Dracocephalum moldavica L. (DTF) in endothelium-intact rat aortic rings##P＜0.01 vs control group;**P＜0.01 vs DTF treated group

2.5 香青蘭總黃酮對(duì)外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放所致血管收縮的影響

采用去內(nèi)皮血管環(huán)觀察了香青蘭總黃酮（40 mg/L）預(yù)處理對(duì)細(xì)胞外鈣所致血管收縮的影響，結(jié)果表明香青蘭總黃酮可明顯抑制細(xì)胞外鈣所致的血管收縮作用（圖5），說明香青蘭總黃酮可通過抑制外鈣內(nèi)流，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞收縮。

通過觀察香青蘭總黃酮處理前后細(xì)胞內(nèi)鈣釋放所致去內(nèi)皮血管收縮幅度表明，香青蘭總黃酮處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放所致的收縮與空白對(duì)照組沒有明顯差異（71.3±2.60 vs 72.34±2.85，P＞0.05），表明香青蘭總黃酮對(duì)內(nèi)鈣釋放所致血管收縮沒有影響。

3 討 論

血管張力的大小直接影響外周血液循環(huán)的阻力，從而影響血壓和心臟負(fù)荷水平，血管擴(kuò)張劑可以改善冠心病或心力衰竭時(shí)的心臟供血，減少心臟做功，成為臨床重要的治療手段之一[5]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠離體胸主動(dòng)脈灌流技術(shù)，觀察香青蘭總黃酮對(duì)血管張力的影響，發(fā)現(xiàn)香青蘭總黃酮對(duì)去甲腎上腺素預(yù)收縮的內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管均有舒張作用，而對(duì)內(nèi)皮完整血管的舒張作用更強(qiáng)，表明香青蘭總黃酮舒張血管作用更大程度上依賴于血管內(nèi)皮。去甲腎上腺素（NE）主要作用于血管平滑肌細(xì)胞α1腎上腺素受體，激活磷脂酶C信號(hào)通路，一方面活化細(xì)胞膜上受體依賴性鈣通道（ROC）和電壓依賴性鈣通道（VOC）的開放，增加細(xì)胞外鈣的攝?。涣硪环矫娲碳ぜ?xì)胞內(nèi)鈣釋放，從而導(dǎo)致血管收縮。血管內(nèi)皮作為調(diào)節(jié)血管張力最主要的組織結(jié)構(gòu)之一，可通過合成并分泌內(nèi)皮依賴性舒張因子——一氧化氮（NO）和前列環(huán)素（PGI2），作用于血管平滑肌細(xì)胞，前者通過活化血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶，活化cGMP依賴信號(hào)通路而舒張血管平滑肌，后者激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP依賴的信號(hào)通路導(dǎo)致血管舒張[6]。在NE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整血管環(huán)上，NO合酶抑制劑L-NAME和環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛均可一定程度地抑制香青蘭總黃酮的血管舒張作用，但并未完全抑制香青蘭總黃酮的作用，表明NO和PGI2信號(hào)通路均參與了香青蘭總黃酮對(duì)內(nèi)皮完整血管的舒張作用，但香青蘭總黃酮的舒張血管作用尚有其他途徑參與。

在去內(nèi)皮血管環(huán)中，NE誘導(dǎo)的血管收縮主要與血管平滑肌細(xì)胞外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用無內(nèi)皮血管環(huán)研究發(fā)現(xiàn)，香青蘭總黃酮預(yù)處理可抑制外鈣內(nèi)流引起的血管收縮。細(xì)胞外高鉀可造成血管平滑肌細(xì)胞膜電位去極化激活VOC，導(dǎo)致細(xì)胞外鈣內(nèi)流而引起血管收縮，本實(shí)驗(yàn)中香青蘭總黃酮對(duì)高鉀所致動(dòng)脈環(huán)收縮沒有明顯影響，表明香青蘭總黃酮的血管舒張作用與VOC活化無關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，去內(nèi)皮血管中香青蘭總黃酮預(yù)處理對(duì)內(nèi)鈣釋放所致血管收縮也沒有明顯影響。上述結(jié)果表明，香青蘭總黃酮主要通過抑制ROC，抑制了平滑肌細(xì)胞的外鈣內(nèi)流所致的血管收縮。

香青蘭作為傳統(tǒng)維吾爾族藥物中重要的“補(bǔ)益心腦”類藥物，經(jīng)過長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐檢驗(yàn)，具有較高的安全性，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明其對(duì)心血管疾病有確切療效[1,2]。本研究發(fā)現(xiàn)香青蘭總黃酮具有較強(qiáng)的舒張血管作用，一方面與其作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶有關(guān)，另一方面可能與其直接抑制血管平滑肌受體依賴性鈣通道有關(guān)。上述結(jié)果表明，香青蘭總黃酮可通過多靶點(diǎn)作用方式以擴(kuò)張血管，香青蘭總黃酮可能是香青蘭治療心血管疾病的主要有效部位，有望被開發(fā)成一種新型的血管擴(kuò)張劑。

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This work was supported by grants from Doctor's Special Fund of Xinjiang Production and Construction Corps(2008GC-12);Key Technologies Research and Development Program of Xinjiang Production and Construction Corps(2007GG23)

Vasodilative Effect ofDracocephalum moldavicaL.Total Flavonoids in Isolated Rat Aortic Rings

YANG Caiyu1,AN Xiwen2,FU Wei1,WANG Ting1,AN Xiaojing1,WANG Zhenhua1,ZHENG Qiusheng1
School of pharmacy,Shihezi University,Shihezi 832002;
Gucheng hospital of Traditional Chinese Medicine,Hebei Gucheng 253800

Mar 25,2010 Accepted：Apr 13,2010

WANG Zhenhua,Tel：+86(993)2057003,E-mail：zhenhuawang@tom.com

Dracocephalum moldavicaL.is a traditional Uygur medicine and has been used widely to benefit heart and brain,with strong cardioprotective effect.However,the molecular basis and mechanisms of its efficacy are not known.Here the vasodilative effect of total flavonoids(DTF)fromDracocephalum moldavica L.on isolated rat aortic rings with or without endothelium was investigated.In the absence of any vasoactive agent，DTF failed to alter basal tension of aortic rings. WhereasDTF (from 10 to 40 mg/L) elicited concentration-dependent relaxation in norepinephrine (NE，10－5mol/L)-pre-contracted aortic rings with or without endothelium,and endothelium removal largely abolished the vasodilative effect of DTF.No effect of DTF was found on KCl-pre-contracted (60 mmol/L)endothelium-intact or denuded aortic rings.The nitric oxide(NO)synthaseinhibitor NG-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) (10－4mol/L),guanylate cyclase inhibitor methylene blue(10－5mol/L),and cyclooxygenase(an enzyme for synthesis prostacycline)inhibitor indomethacin(10－5mol/L)significantly inhibited DTF vasodilative effect on endothelium-intact aortic rings,which proved thatNO and prostacycline pathways were involved in DTF's vasodilative effect. DTF pretreatment(40 mg/L)significantly inhibited extracellular Ca2+influx switched aortic contraction,but had no effect on PE-induced transient contraction through Ca2+release from sarcoplasmic reticulum.Those new findings implied that DTF induced both endothelium-dependent and independent relaxation.Moreover,NO and prostacycline mediated pathways are likely involved in endothelium-dependent relaxation,whereas,inhibition of receptor-operated Ca2+channel contributes,at least in part,to endothelium-independent relaxation.

Dracocephalum moldavica L.; Totalflavonoids; Vasodilative effect; Calcium channel;Eendothelium

2010-03-25；接受日期：2010-04-13

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)博士資金項(xiàng)目(2008GC-12)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技攻關(guān)計(jì)劃(2007GG23)

王振華，電話：(0993)2057003，E-mail：zhenhuawang@tom.com

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