果艷鳳 王會(huì)麗 劉麗萍 韓淑英 河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科(唐山 063000)

黃蒲祛毒顆粒為本院醫(yī)院制劑,處方由黃柏 60g,紫花地丁、蒲公英、苦參、馬齒莧、川椒、芒硝各 30g組成。本制劑具有清熱解毒,利濕止血之功效,用于濕熱下注引起的內(nèi)痔、外痔、混合痔、肛裂、肛瘺、肛周膿腫以及肛門(mén)濕疹等。表現(xiàn)為便鮮血、肛門(mén)疼痛、紅腫、瘙癢、時(shí)有膿水、舌苔黃膩、脈象弦滑。

1 材料 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性清潔級(jí) SD大鼠,無(wú)孕,體重在 170～210g,3～4月齡。由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK＜豫＞2005-0001。飼料為本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心自制干糕。大鼠 5只 /籠 ,自由飲水和攝食。白色豚鼠,雌性(無(wú)孕),體重 240～300g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK＜豫＞ 2005-0001。健康白色雌性家兔,體重 1.90± 0.15kg。實(shí)驗(yàn)溫度為 21±2℃,濕度 65± 5%,采光 12h/d,排風(fēng)扇通風(fēng),4次 /d,每次至少 30min,環(huán)境安靜無(wú)噪音。

1.2 藥物和試劑硫化鈉(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠(chǎng),批號(hào):200061138),2,4二硝基氯苯 (上海試劑一廠(chǎng)提供,批號(hào) 99-07-01,用 70%乙醇將其配成 1%的致敏濃度和 0.1%激發(fā)濃度)。藥物黃棕色至黑棕色顆粒(用藥量為 0.25g/kg)。

2 方法 2.1 急性毒性試驗(yàn) 選擇健康雌性 SD大鼠 64只,適應(yīng)環(huán)境 5d后,于實(shí)驗(yàn)前 24h用 8%硫化鈉脫掉大鼠背部脊柱兩側(cè)毛約 8cm×4cm2,其中 32只大鼠保持皮膚完整不受損,隨即分成 4組,每組 8只,即對(duì)照組 (蒸餾水),黃蒲祛毒顆粒高劑量組(將黃蒲祛毒顆粒用蒸餾水配制成 125g/100mL溶液,按 40mL/kg均勻涂抹于脫毛處,每次 10mL/kg,1h1次,共 4次給完),給藥量為 50g/kg,相當(dāng)人用量的 200倍(按60kg)。黃蒲祛毒顆粒中劑量組(將黃蒲祛毒顆粒用蒸餾水配制成 62.5g/100mL溶液,按 40 mL/kg均勻涂抹于脫毛處,每次10 mL/kg,1h 1次,共 4次給完)給藥量為 25g/kg,相當(dāng)人用量的 100倍(按 60kg)。黃蒲祛毒顆粒低劑量組(將黃蒲祛毒顆粒用蒸餾水配制成 31.25g/100mL溶液,按 40mL/kg均勻涂抹于脫毛處,每次 10mL/kg,1h1次,共 4次給完。),給藥量為12.5g/kg,相當(dāng)人用量的 50倍 (按 60kg)。另 32只大鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)用 16號(hào)針頭,在脫毛且消毒的皮膚上劃“井”字,以皮膚滲血為度,其分組與給藥劑量同完整皮膚急性毒性試驗(yàn)。涂抹藥物后每日觀(guān)察并紀(jì)錄大鼠的體重、精神狀態(tài)、四肢活動(dòng)、皮膚、毛發(fā)、眼睛、黏膜、呼吸的變化,有無(wú)發(fā)抖、震顫、流涎、腹瀉、嗜睡、昏迷等全身中毒表現(xiàn)和死亡情況。

2.2 皮膚刺激性試驗(yàn) 2.2.1 方法:選擇健康白色家兔 16只,雌雄兼有 ,體重 1.90±0.15kg,適應(yīng)環(huán)境 5d.于給藥前 24h在兔背部脊柱兩側(cè)用 8%硫化鈉脫毛 (每側(cè)約 50cm2,無(wú)紅斑、水腫及破損)。 16只家兔隨機(jī)分成 4組,每組 4只,設(shè)單次涂抹完整皮膚組、單次涂抹破損皮膚組、多次涂抹完整皮膚組和多次涂抹破損皮膚組。均涂抹給藥(破損皮膚組,每只家兔背部脊柱兩側(cè)去毛區(qū)在涂藥前用針頭在涂約部位皮膚劃“井”字以滲血為度),左側(cè)為受試區(qū),右側(cè)為對(duì)照區(qū)。分別于給藥區(qū)涂抹75%黃蒲祛毒顆粒溶液 0.2mL/cm2;對(duì)照區(qū)涂以等量的蒸餾水,用一層玻璃紙覆蓋保濕 ,再加紗布覆蓋保護(hù),再用膠布適當(dāng)固定。單次涂抹組:涂抹后 24h,用溫水洗去殘留的受試藥;多次涂抹組:2次 /d,連續(xù) 7d,末次涂抹后 24h,用溫水洗去殘留的受試藥。去除受試物后 1h、24h、48h、72h觀(guān)察涂抹部位有無(wú)紅斑和水腫等情況,以及上述變化的恢復(fù)情況和時(shí)間。

2.2.2 結(jié)果判定及評(píng)價(jià):每只動(dòng)物皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分按下表進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分,計(jì)算出平均分值。皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)按無(wú)刺激性 (＜0.5,輕度刺激性 (＜2.0中度刺激性(＜6.0),強(qiáng)刺激性(＞ 6.0)進(jìn)行。

表1 皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.3 皮膚過(guò)敏試驗(yàn) 2.3.1 方法:取健康白色雌性豚鼠,于試驗(yàn)前 24h,采用 8%硫化鈉脫毛劑,將全部受試豚鼠背部脊柱兩側(cè)去毛(每側(cè)約 4cm×4cm2,無(wú)紅斑、水腫及破損)。24只豚鼠按體重隨機(jī)分成 3組,每組 8只,分別是受試藥組(黃蒲祛毒顆粒)、空白對(duì)照組(蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(2,4二硝基氯代苯)。將 75%黃蒲祛毒顆粒溶液 0.5mL涂在左側(cè)脫毛區(qū),6h后用溫水擦去殘留受試藥,第 7d和 14d以同樣方法重復(fù)?？瞻讓?duì)照組涂蒸餾水 0.5mL,陽(yáng)性對(duì)照組涂以 1%的 2,4二硝基氯苯 0.5mL。于末次涂藥后 14d時(shí)在動(dòng)物右側(cè)脫毛區(qū)涂藥 0.5mL,6h后去除受試物,立即觀(guān)察,并于 24h、48h和 72h重復(fù)觀(guān)察豚鼠脫毛區(qū)皮膚涂抹部位有無(wú)紅斑和水腫等過(guò)敏反應(yīng)情況?？瞻讓?duì)照組與陽(yáng)性物對(duì)照組方法均同受試藥物組。

2.3.2 結(jié)果判定及評(píng)價(jià):實(shí)驗(yàn)結(jié)果按衛(wèi)生部藥政管理局發(fā)布的《中藥新藥研究指南》皮膚過(guò)敏反應(yīng)程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分,并計(jì)算平均分值。每只動(dòng)物皮膚過(guò)敏反應(yīng)程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無(wú)紅斑為 0分;勉強(qiáng)可見(jiàn)為 1分;中度紅斑為 2分;嚴(yán)重紅斑為 3分;紫紅色紅斑為 4分。無(wú)水腫為 0分;勉強(qiáng)可見(jiàn)為 1分;可見(jiàn)為 2分;皮膚隆起約 1mm,輪廓清楚為 3分;水腫隆起 1mm以上并范圍擴(kuò)大為 4分。進(jìn)行過(guò)敏反應(yīng)評(píng)分,計(jì)算出平均分值。致敏率分類(lèi)按弱致敏性 (0～10%),輕度致敏性(20%～30%),中度致敏性(40%～60%),高度致敏性(70%～80%),極度致敏性(90%～100%)進(jìn)行。根據(jù)致敏率類(lèi)別進(jìn)評(píng)價(jià)。

3 結(jié)果 3.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果涂抹黃蒲祛毒顆粒后,大鼠未見(jiàn)異常反應(yīng),飲食,體重 ,大小便和活動(dòng)均正常;完整皮膚急性毒性試驗(yàn)組大鼠皮膚無(wú)紅斑,無(wú)水腫,無(wú)死亡;破損皮膚急性毒性試驗(yàn)組大鼠皮膚劃痕處可見(jiàn)紅腫,結(jié)痂,劃痕周?chē)つw無(wú)紅腫,無(wú)死亡,與對(duì)照組比較無(wú)差別。

3.2 皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果一次給藥或多次給藥結(jié)束后,對(duì)照區(qū)與受試區(qū)比較觀(guān)察,皮膚刺激反應(yīng)強(qiáng)度均 ＜0.5分,多次給藥期間也未觀(guān)察到皮膚有紅斑、水腫等刺激反應(yīng),涂藥部位無(wú)色素沉著,無(wú)出血點(diǎn),無(wú)皮膚粗糙及皮膚菲薄等現(xiàn)象。結(jié)果表明:黃蒲祛毒顆粒一次給藥或多次給藥對(duì)兔完整皮膚和破損皮膚均無(wú)刺激性。

3.3 皮膚過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果 受試組和空白組各 8只豚鼠皮膚未出現(xiàn)紅斑和水腫,均為 0分;陽(yáng)性對(duì)照組 8只豚鼠中 1只出現(xiàn)重度紅斑 3× 1分,4只出現(xiàn)中度紅斑 2× 4分,1只可見(jiàn)輕度紅斑為 1×1分,2只豚鼠出現(xiàn)水腫并紅斑為 4×2分 ,陽(yáng)性藥反應(yīng)總積分 20分,平均為 2.5分。陽(yáng)性致敏物 2,4二硝基氯苯動(dòng)物皮膚受試區(qū)自激發(fā)給藥 1h后出現(xiàn)紅斑,6h最明顯,24h逐漸消退,72h后紅斑仍可勉強(qiáng)看見(jiàn),致敏達(dá) 100%。受試藥物黃蒲祛毒顆粒組豚鼠皮膚受試區(qū)自激發(fā)給藥后 72h內(nèi)未出現(xiàn)紅斑及水腫形成,與空白對(duì)照組比較無(wú)差別。

4 討 論 黃蒲祛毒顆粒由黃柏、紫花地丁、蒲公英、苦參、馬齒莧、川椒、芒硝組成。黃柏清熱解毒利濕,尤以下焦為甚者,為君藥。紫花地丁、蒲公英 、苦參 、馬齒莧清熱解毒、止血止癢為臣藥,佐以川椒止痛,芒硝軟堅(jiān)散結(jié)。全方共奏清熱解毒,利濕止血之功,治療濕熱下注引起的內(nèi)痔、外痔、混合痔、肛裂、肛門(mén)濕疹等。通過(guò)對(duì)黃蒲祛毒顆粒試驗(yàn)研究表明:黃蒲祛毒顆粒對(duì)大鼠完整,破損皮膚均無(wú)急性毒性反應(yīng)。對(duì)白兔完整,破損皮膚無(wú)刺激性。對(duì)豚鼠皮膚不產(chǎn)生致敏作用,說(shuō)明黃蒲祛毒顆粒是安全的局部外用藥。適合于臨床使用。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編 [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1993:204-208.

[2]孫敬方.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué) [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:191,374-375.

[3]王北嬰,李儀奎.中藥新藥研制開(kāi)發(fā)技術(shù)與方法[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社 ,2001:811-813.

[4]徐淑云 ,卞如濂,陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué) [M].第二版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1991:207-209.