楊 鋒 李彥民 李引剛 竇群立 陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科創(chuàng)傷病區(qū)(咸陽 712083)

抗風(fēng)濕顆粒來源于陜西省名老中醫(yī)李彥民主任醫(yī)師經(jīng)驗方—抗風(fēng)濕湯,經(jīng)現(xiàn)代工藝技術(shù)改進劑型制成的顆粒劑。此方在 20多年治療寒濕阻絡(luò)型痹病中取得了滿意的臨床效果[1]。本實驗是進一步觀察本方對實驗動物免疫功能的影響,為臨床治療痹病提供一定的實驗依據(jù)。

1 實驗材料及方法 1.1 實驗動物 合格成年 SD大鼠 48只,雌雄各半 ,體重 160± 2g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,動物質(zhì)量合格證書號:醫(yī)動字第 08— 005號。

1.2 實驗用藥及主要試劑 1.2.1 抗風(fēng)濕顆粒:由威靈仙、秦艽、細辛、穿山龍、制川烏、烏梢蛇等組成。大鼠用量按文獻方法折算[2],配制成不同濃度溶液 ,大劑量每 mL含生藥 5.4g,中劑量每 mL含生藥 1.8g,小劑量每 mL含生藥 0.6g。

1.2.2 雷公藤多甙片:魯南制藥股份有限公司 國藥準(zhǔn)字Z37020344。 10%綿羊紅細胞懸液 ,由寶泰克生物制品有限公司提供。豚鼠補體:第四軍醫(yī)大學(xué)免疫實驗室制備。完全弗氏佐劑 CFA,由北京鼎國生物制品公司出品。

1.3 實驗分組及給藥 全部大鼠購回后適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周,然后隨機分為 6組,每組 8只,A組正常組,B組模型組,C組雷公藤多甙組,D、E、F分別為抗風(fēng)濕顆粒小、中、大劑量組。于 B、C、D、E、F五組大鼠每只右后足足墊皮內(nèi)注射 0.1mL CFA。造模成功后,每組每日灌胃 1次,A、B組灌生理鹽水 2mL/只,C組灌雷公藤多甙混懸液 2mL/只(0.6g/mL),D、E、F分別給抗風(fēng)濕顆粒小、中、大劑量 2mL/只,連續(xù) 30d。

1.4 試驗方法 1.4.1 淋巴細胞轉(zhuǎn)化率:末次給藥后前 3d,每只大鼠腹腔注射 ConA0.3～0.5mg。 3d后,通過摘除大鼠眼球采集外周血,加入預(yù)先加有肝素的試管中。取 1小滴抗凝血滴在玻片中央,用推片將血液涂開。自然干燥。取甲醇 1～2滴滴在涂片上,自然干燥。加姬姆薩或瑞氏染液 2滴于涂片上,同時加 2滴水,用吸管水平涂開,使染液均勻覆蓋涂抹面,染色時間為 5～10min。自來水細水沖洗染液,然后用吸水紙輕輕吸干玻片上的液體。顯微鏡觀察結(jié)果,計數(shù)淋巴轉(zhuǎn)化細胞,計算轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù) /(轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)+未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù))×100%。

1.4.2 抗風(fēng)濕顆粒對大鼠巨噬細胞吞噬功能的影響:指標(biāo)檢測 末次給藥后 24h尾靜脈注射印度墨汁(用生理鹽水 1:1稀釋)0.1mL,注射后 lmin,5min眶內(nèi)采血各 1次,加入到 2mL的0.1%Na2CO3溶液中搖勻。用 721型分光光度計在 680nm下測光密度值 OD。第 2次采血后處死動物,取肝脾稱重,計算吞噬指數(shù) K及吞噬系數(shù)α K= (logOD1-logOD5)/t5-t1=(logOD1/OD5)/4,α=體重 /肝脾重×K1/3。Ⅲ 抗風(fēng)濕顆粒對特異性體液免疫功能的影響。

1.4.3 溶血素水平:給藥第 1d,用 10%綿羊紅細胞 0.2mL/只,給大鼠腹腔注射進行免疫,末次給藥后 24h眼眶采血 ,分離血清,倍比稀釋(500倍以上),反應(yīng)管內(nèi)依次加入經(jīng)稀釋的血清1mL,5%的綿羊紅細胞 0.5mL,10%的補體 1 mL置 37℃,恒溫水浴中保溫 30min,然后移至冰浴終止反應(yīng),1500r/min離心5min取上清液 1mL,加入都氏試劑 3mL,可出現(xiàn)棕色,搖勻放置 10min,于 540nm波長下比色,讀取吸收度。然后測 SRBC半數(shù)溶血值:取 5%SRBC加入都氏液至 4mL,比色讀取吸光度值,即為實驗中所用 SRBC半數(shù)溶血時的吸光度值。樣品管中溶血值 CH50計算式為:每只大鼠的血清 CH50=樣品吸光度值 /SRBC半數(shù)溶血時的吸光度值×稀釋倍數(shù)

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多個組比較用單因素方差分析,組間多重比較用 LSD-t檢驗,檢驗水準(zhǔn)取雙側(cè) α=0.05。

2 實驗結(jié)果

表1 抗風(fēng)濕顆粒對 AA大鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的影響

表2 抗風(fēng)濕顆粒對巨噬細胞吞噬功能的影響

表3 抗風(fēng)濕顆粒對大鼠溶血素水平的影響

表4 大鼠胸腺、脾臟指數(shù)(mg/100g體重)

從表 4可以看出:①胸腺指數(shù):雷公藤多甙組與空白組比較有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.05。抗風(fēng)濕顆粒中、小劑量與空白組比較無統(tǒng)計學(xué)意義 P＞0.05.抗風(fēng)濕大劑量則顯著降低胸腺指數(shù),P＜0.05。②脾臟指數(shù):雷公藤多甙組與其余各組比較有統(tǒng)計學(xué)意義 P＜0.05?？癸L(fēng)濕顆粒大、中、小劑量與空白組比較無統(tǒng)計學(xué)意義 P＞0.05。

討 論 抗風(fēng)濕顆粒對 T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的影響淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低可以反映機體的細胞免疫水平,因此可作為測定機體免疫功能的指標(biāo)之一。本試驗采用形態(tài)計數(shù)法讀取 T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。從實驗 1.4.1可以看出:雷公藤多甙組與其它各組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)即雷公藤多甙可顯著降低大鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率?？癸L(fēng)濕顆粒大劑量組與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),與雷公藤多甙組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)即:抗風(fēng)濕顆粒大劑量明顯降低大鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。這表明抗風(fēng)濕顆粒大劑量可明顯抑制大鼠細胞免疫功能。中小劑量組對淋巴細胞轉(zhuǎn)化率無明顯影響。

對非特異性屏障機能的影響 巨噬細胞作為機體天然免疫的組成部分,不僅對機體的屏障機能起著重要作用,并且參與免疫應(yīng)答,還可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì),即:各種細胞因子和激素樣物質(zhì) ,如:IL-l、 TN F-α、 IFN、PGE2、C、 NO 、溶菌酶等。在產(chǎn)生特異性細胞免疫和體液免疫之前發(fā)揮防御作用。本實驗中膠體碳顆粒(印度墨汁 )進入血循環(huán)后,迅速為單核巨噬細胞所清除,其中主要為定居在肝和脾臟的巨噬細胞所吞噬。肝臟Kupffer細胞攝取約 90%,脾臟巨噬細胞約 10%。若將異物量恒定,則自血流中攝取的速率可以反映吞噬細胞的吞噬功能。以血碳濃度對數(shù)值為縱坐標(biāo),時間為橫坐標(biāo),兩者呈直線關(guān)系,此直線斜率 K可表示吞噬速率。因動物肝脾重量不等,K值亦不同,故以校正的吞噬指數(shù)α[3]表示。從實驗 1.4.2可以看出:雷公藤多甙組與其它各組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)即雷公藤多甙可顯著降低大鼠巨噬細胞吞噬血中膠體碳粒的速度?？癸L(fēng)濕顆粒各組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)即:抗風(fēng)濕顆粒對大鼠巨噬細胞吞噬功能無明顯影響。這表明抗風(fēng)濕顆粒不影響非特異性屏障機能。

對特異性體液免疫的影響本實驗中綿羊紅細胞致敏的大鼠血清中的循環(huán)抗體—溶血素(IgM)與綿羊紅細胞一起在補體參與下產(chǎn)生溶血反應(yīng)。血清中溶血素含量可以通過溶血過程中釋放的血紅蛋白量來檢測。從實驗 1.4.3可以看出抗風(fēng)濕組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)即:抗風(fēng)濕顆粒對特異性抗體生成無明顯影響。

對免疫器官的影響胸腺是誘導(dǎo) T淋巴細胞分化成熟的重要器官。 T淋巴細胞擔(dān)負著機體的細胞免疫功能,并參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié),所以胸腺功能缺陷能引起細胞免疫功能的下降及對某抗原的抗體產(chǎn)生受損。胸腺重量可以間接反映它的功能[3]。脾臟可以分化出淋巴細胞,它是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場所,它含有更多的 B細胞和漿細胞,因此在抗體生成中起重要作用。徐立[4],許得盛[5]等在實驗中應(yīng)用胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)反映藥物對這些免疫器官的影響。胸腺、脾臟指數(shù)增大,提示藥物有免疫促進作用。反之有免疫抑制作用。從表 4可以看出:①胸腺指數(shù):抗風(fēng)濕顆粒中、小劑量與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義 P＞0.05?？癸L(fēng)濕大劑量則顯著降低胸腺指數(shù),P＜0.05。②脾臟指數(shù):抗風(fēng)濕顆粒大、中、小劑量與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義 P＞0.05。雷公藤多甙組顯著降低胸腺、脾臟指數(shù),即有廣泛抑制免疫器官及免疫器官萎縮作用。抗風(fēng)濕中、小劑量對免疫器官無明顯作用。大劑量對中樞免疫器官有抑制作用,對外周免疫器官則無影響。

現(xiàn)代藥理研究顯示,以上諸藥均有不同程度的抗炎及免疫抑制效應(yīng)[6]。同我們實驗中復(fù)方顆粒劑的實驗結(jié)果基本一致?？傮w來看,抗風(fēng)濕顆粒具有選擇性抑制細胞免疫的作用,對于特異性體液免疫和非特異性屏障機能無明顯作用。這對于抗風(fēng)濕藥物來說是具有積極意義的,它可以避免廣泛的免疫抑制所帶來的副作用。

[1]焦百樂 ,李引剛,李彥民.抗風(fēng)濕湯治療寒濕阻絡(luò)型痹病臨床研究 [J].現(xiàn)代中醫(yī)藥,2003,23(5):10.

[2]徐叔云.藥理實驗方法學(xué) [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:157.

[3]吳敏毓.醫(yī)學(xué)免疫學(xué) [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:205.

[4]徐 立.血紅林螞蟻粉抗炎、鎮(zhèn)痛作用的實驗研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報 ,1997,13(4):213.

[5]許得盛.類風(fēng)關(guān)合劑治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床及實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,1996,(1):14.

[6]丁光霞,胡定華,李菊仙.川附子水溶性提取物對“陽虛”小鼠免疫功能的影響 [J].陜西中醫(yī),1985,6(7):299.