姚 超，石桂英，陳陟陽，黃 馨，胡永艷，鞠振宇

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021)

研究報告

RunX3對小鼠骨髓造血干細胞功能的影響

姚 超，石桂英，陳陟陽，黃 馨，胡永艷，鞠振宇

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021)

目的 研究 RunX3基因?qū)υ煅杉毎晕腋潞头只芰Φ挠绊?。方法流式細胞術(shù)測定小鼠骨髓干細胞和外周血單個核細胞的比例;通過競爭性骨髓移植實驗檢測 RunX3轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓干細胞的功能。結(jié)果移植后來源于 RunX3－/－小鼠骨髓干細胞供體的外周血細胞占總外周血細胞的比例與野生對照鼠相比無明顯差異，移植后來源于 RunX3－/－小鼠骨髓干細胞供體的外周血中髓系細胞占總外周血髓系細胞的比例較野生型對照鼠高。結(jié)論RunX3基因缺失對骨髓造血干細胞的自我更新沒有影響，但其可能參與了骨髓造血干細胞的分化過程。

R－33;小鼠，基因敲除;骨髓造血干細胞

RunX即編碼具有Runt結(jié)構(gòu)域蛋白的基因，其家族成員包括RunX1、RunX2和RunX3，它們都有一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 runt，該結(jié)構(gòu)域與果蠅的成對控制(pair rule)基因 runt序列同源。作為 RunX家族的重要成員，RunX3位于人染色體1p36.1區(qū)域，至少具有5個外顯子。在小鼠胚胎形成過程中RunX3表達于造血器官、表皮附屬物、骨骼以及感覺神經(jīng)中樞［1］。RunX3是胃上皮細胞主要生長調(diào)控因子，RunX3敲除小鼠由于上皮細胞的過度增殖和凋亡抑制表現(xiàn)為胃粘膜增生。RunX3在TGF－β介導的腫瘤抑制信號途徑中起重要作用，該基因功能的缺失導致胃癌的發(fā)生和進展［2，3］。RunX3和RunX1基因在抑制 CD4表達方面具有協(xié)同性［4］。RunX3基因敲除導致加速成熟，對 T細胞刺激朗格漢斯細胞缺乏和樹突細胞的加強以及使β2整合素家族如CD11a、CD11b、CD11c的表達異常［5］。綜合前期研究結(jié)果提示RunX3可能與細胞增殖、凋亡、分化有關，對免疫系統(tǒng)疾?。?］和癌癥的發(fā)生有影響。然而，目前還沒有研究報道RunX3和造血干細胞的自我更新能力以及應激反應之間的關系。為了研究RunX3是否直接參與骨髓造血干細胞本身的自我更新能力的基因調(diào)控，我們利用競爭性骨髓造血干細胞移植的方法來研究RunX3基因在造血干細胞自我更新和分化中的功能。

1 方法

1.1 競爭性骨髓移植實驗

供體小鼠:RunX3－/－小鼠為12周齡;對照組小鼠采用 C57BL/6野生型，為 12周齡。受體小鼠: C57BL/6野生型，為8周齡。競爭者小鼠:為CD45. 1亞型C57BL/6小鼠，均來自北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2009－0007，動物使用許可證號:SYXK(京)2005－0001。受體小鼠在接受骨髓移植前4 h接受致死劑量的放射線照射，劑量率0.5～1 Gy/min，總劑量達9 Gy。無菌條件下制備RunX3－/－小鼠和野生型對照小鼠的骨髓單個核細胞作為移植供體，與競爭者小鼠骨髓單個核細胞1:1混合，將等量的細胞懸液(約200～300 μL，含單個核骨髓細胞約4×106個)經(jīng)眼后靜脈注射到的各組受體小鼠體內(nèi)。實驗所用小鼠飼養(yǎng)在SPF級動物飼養(yǎng)室 ，移植后1周給予受體小鼠口服抗生素預防感染，并注意飲食飲水補給，以提高移植成活率。

1.2 5－氟尿嘧啶移植后再處理

通過腹腔注射給予移植后5月的受體小鼠150 mg/kg的5－氟尿嘧啶(5－FU)。使得骨髓中休眠的造血細胞重新開始造血。在給予5－FU后7 d和1月時取外周血分析供體來源的血細胞比例［7］。

1.3 PCR方法鑒定RunX3-/-小鼠的基因型

提取小鼠基因組DNA，PCR鑒定基因型。反應條件:95℃變性5 min;95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃30 s，30個循環(huán);72℃延伸10 min。鑒定引物為上游5′－GAGATAGATGGGGTCAGAGG－3′，下游5′－AGG TCGGGTCTAGAGAATAGG－3′(Invitrogen)，RunX3－/－產(chǎn)物長度300 bp，WT產(chǎn)物長度200 bp，PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司(圖1)。

注:Marker為DL2000 marker，H20為空白對照，WT為野生型對照，1，2，3為RunX3－/－。

1.4 流式細胞術(shù)分析

我們對競爭性移植的供體小鼠的脾臟，胸腺，骨髓細胞進行分析。并在移植后1月，3月分析受體小鼠外周血中供體來源細胞的嵌合率。將脾臟、胸腺、骨髓細胞分別制成單個細胞混懸液，懸浮于 staining medium(2.5% FBS在 PBS中)，供體脾臟、胸腺、骨髓細胞采用 CD4－APC、CD8－FITC、B220－PE、CD11b－Percp－cy5.5，并冰上孵育30 min。流式細胞儀采用FASCAria(Becton Dickinson)。骨髓細胞同時還采用 LSK分析，lineage marker antibodies－biotin(biotinylated anti－Ter－119抗體、biotinylated anti－Gr－1抗體、biotinylated anti－CD11b抗體、biotinylated anti－B220抗體、biotinylated anti－IL－7R 抗體、biotinylated anti－CD4抗體、biotinylated anti－CD8抗體)、SA－Percpcy5.5、Sca－1－PE及 ckit－APC。

移植后外周血嵌合率分析:通過眼后靜脈叢取外周血50～100 μL，采用0.1 mol/L EDTA20 μL抗凝，Redbloodcell(RBC)lysis buffer(0.83% NH4Cl)裂解紅細胞。采用 CD45.1－PE、CD45.2－Percp－cy5.5、B220－FITC、CD11b－APC分別標記供受體來源的B淋巴細胞和髓系細胞，并計算供體來源的外周血細胞比例。

1.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)結(jié)果均用x±s表示，組間資料比較采用Student t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 RunX3-/-小鼠的造血系統(tǒng)分析

為了解RunX3基因的缺失對年輕小鼠(12周)造血系統(tǒng)所造成的影響，我們分析了 RunX3－/－小鼠和野生型對照小鼠的骨髓造血的情況(圖2A，2B)。結(jié)果顯示RunX3基因缺失不但對小鼠的骨髓B淋巴細胞和髓系細胞的發(fā)育沒有影響(圖2C)。這些數(shù)據(jù)表明 RunX3基因?qū)δ贻p小鼠的骨髓造血系統(tǒng)向B淋巴細胞和髓系細胞分化的能力沒有影響。進而，我們分析了RunX3基因?qū)δ贻p小鼠骨髓造血干細胞數(shù)量的影響，結(jié)果顯示RunX3敲除小鼠骨髓細胞總數(shù)沒有差異，同時骨髓細胞中 lineage陰性，Sca－1和c－kit雙陽性的細胞也沒有差異。說明年輕小鼠在正常生理狀態(tài)時，RunX3基因?qū)υ煅杉毎€(wěn)態(tài)維持及其分化沒有影響。

圖2 RunX3－/－小鼠骨髓中白細胞各亞群細胞比例分析Note:2C:the histogram showing the percentage of leukocyte subsets in the bone marrow of RunX3－/－mice.WT:wild－type mice;RunX3－/－:RunX3－/－mice.Fig.2 The percentage of leukocyte subsets in the bone marrow of RunX3－/－－mice

2.2 競爭性骨髓移植及5-FU處理

為進一步研究 RunX3基因?qū)υ煅杉毎脑煅亟芰烷L期自我更新能力是否有影響，我們進行了競爭性骨髓移植及5－FU處理實驗。

2.2.1 競爭性骨髓移植是評價造血干細胞自我更新能力的標準試驗:放射性照射后的受體中，供體來源的骨髓造血干細胞在造血重建的過程中，對外周血細胞的貢獻在移植后1月時主要來自于短期骨髓干細胞的造血及分化功能，在3月后則來自于長期干細胞的功能表現(xiàn)。我們利用FACS分析受體小鼠外周血來源(圖3A、B、E、F)。統(tǒng)計結(jié)果顯示:移植1月后來源于 RunX3－/－小鼠骨髓干細胞供體的外周血細胞占總外周血細胞的比例與野生對照鼠相比無明顯差異(圖4A)。進一步分析外周血細胞各個亞群中供體來源的血細胞的比例顯示，移植一月時來源于 RunX3－/－小鼠骨髓干細胞供體的外周血中髓系細胞占總外周血髓系細胞細胞的比例較野生對照鼠高(圖4B)。骨髓移植后3個月的流式分析結(jié)果與移植后 1個月時的分析結(jié)果趨勢一致(圖4C)。說明RunX3基因缺失對骨髓短期和長期造血干細胞的自我更新能力沒有影響，但是可能對骨髓造血干細胞向髓系血細胞的分化能力有促進作用。

2.2.2 為了進一步了解在應激狀態(tài)和損傷修復情況下，RunX3基因缺失對骨髓短期和長期造血干細胞的自我更新能力是否影響，我們對移植后3個月的小鼠進行 5－FU處理。5－FU是 S期抑制劑，在DNA復制過程中可阻斷胸苷的合成［8］。使用5－FU處理后，可將增殖活躍的細胞殺死，使得處于休眠期的細胞進入細胞周期。利用5－FU處理可以進一步明確供體骨髓造血干細胞在損傷修復情況下的增殖及分化功能。在5－FU處理1周后外周血流式分析結(jié)果顯示:來源于 RunX3－/－小鼠骨髓干細胞供體的外周血細胞占總外周血細胞的比例與野生對照鼠相比無明顯差異;而來源于 RunX3－/－小鼠供體的外周血髓系細胞占總外周血髓系細胞的比例較野生對照鼠高(圖4D)。在5－FU處理1月后，來源于RunX3－/－小鼠的外周血細胞和髓系細胞分別占總外周血細胞和總髓系細胞的比例與野生對照鼠相比無明顯差異(圖 4E)。這些數(shù)據(jù)提示RunX3基因缺失不影響骨髓造血干細胞在應激狀態(tài)下的損傷修復能力，但是可能影響骨髓造血干細胞的分化能力。

圖3 受體小鼠外周血中供體來源的細胞在骨髓移植后所占比例流式分析圖Note:A，B，C，D:FACS plots of the donor wild type mice.E，F(xiàn)，G，H:FACS plots of the donor RunX3－/－mice.A，E:FACS plots of the proportion of leukocyte subsets in peripheral blood cells of recipient mice.B，F(xiàn):The proportion of leukocyte subsets in peripheral blood cells of recipient mice.C，G:Histogram showing the percentage of donor－derived peripheral blood cells in total peripheral cells after competitive transplantation.D，H:Histogram showing the percentage of donor－derived cells in subsets of peripheral cells.WT:wild－type mice;RunX3－/－:RunX3－/－mice.DON: donor－derived cells.Fig. 3 FACS plots show the percentage of donor－derived peripheral blood cells in recipient mice after competitive transplantation

2.2.3 為了進一步明確RunX3基因缺失對骨髓造血干細胞分化能力的影響，我們分析了 RunX3－/－小鼠供體來源的外周血細胞中白細胞各亞群所占的比例(圖3C、D、G、H)。結(jié)果顯示:在移植后1個月和3個月時，供體來源的B淋巴細胞和髓系細胞占總供體外周血細胞的比例在 RunX3－/－組和野生對照組之間差異無顯著性(圖5A、B)。在5－FU處理一周后外周血中髓系細胞比例 RunX3敲除組較野生組升高(圖5C)，在5－FU處理一月后外周血中髓系細胞比例兩組無明顯差別，但B細胞比例下降(圖5D)。這組數(shù)據(jù)提示在應激的早期RunX3基因的缺失可能導致了骨髓造血干細胞向髓系細胞的分化增多，而隨著時間的推移，骨髓造血干細胞向B淋巴細胞的分化也逐漸減少。

3 討論

已知RunX3基因?qū)τ诟杏X神經(jīng)中樞，免疫系統(tǒng)，多種癌癥的發(fā)生均有重要作用，尤其是對于 T淋巴細胞的發(fā)育有重要調(diào)節(jié)作用［9］。然而 RunX3基因?qū)τ谠煅杉毎挠绊戇€不清楚。我們對RunX3－/－小鼠骨髓干細胞的穩(wěn)態(tài)維持和造血重建能力進行了研究。競爭性骨髓移植實驗是判斷干細胞自我更新能力的標準的實驗。應用致死劑量的放射線照射清除受體小鼠自體的骨髓干細胞后進行移植供體骨髓，同時每只受體移植入等量的競爭者骨髓細胞，受體小鼠外周血細胞主要來源于供體骨髓干細胞和競爭性的骨髓干細胞的共同貢獻。由于競爭性骨髓細胞作為內(nèi)參，同時每只受體小鼠所接受的受試供體骨髓細胞數(shù)量也是相等的，因此供體來源的外周血細胞所占的比例直接反映供體骨髓干細胞的自我更新能力。

圖4 骨髓移植后受體小鼠外周血中供體來源的細胞所占比例Note:(A)Histogram showing the percentage of donor－derived peripheral blood cells in the total peripheral cells after competitive transplantation.(B) Histogram showing the percentage of donor－derived cells in the subsets of peripheral cells at one month after competitive transplantation.(C)Histogram showing the percentage of donor－derived cells in the subsets of peripheral cells at three months after competitive transplantation.(D)Histogram showing the percentage of donor－derived cells in the subsets of peripheral cells at one week after 5－FU treatment.(E)Histogram showing the percentage of donorderived cells in the subsets of peripheral cells at one month after 5－FU treatment.* P＜0.05;WT:wild－type mice;RunX3－/－:RunX3－/－mice.Fig.4 The percentage of donor－derived peripheral blood cells in recipient mice after competitive transplantation

以往研究表明RunX3基因缺失的小鼠 CD11b陽性的髓系細胞在過敏性氣道炎癥狀態(tài)下顯著增加［5］。我們研究發(fā)現(xiàn)，RunX3基因?qū)δ贻p小鼠的骨髓造血系統(tǒng)向B淋巴細胞和髓系細胞分化的能力沒有影響，而且年輕小鼠在正常生理狀態(tài)時，RunX3基因?qū)υ煅杉毎€(wěn)態(tài)維持及其分化沒有影響。在移植后的應激狀態(tài)下 RunX3－/－小鼠的骨髓造血干細胞在受體小鼠體內(nèi)的造血重建能力方面沒有顯著差異，但我們發(fā)現(xiàn)在應激狀態(tài)下RunX3敲除小鼠的骨髓造血干細胞在受體小鼠體內(nèi)向髓系細胞分化能力增強，而向 B淋巴細胞的分化能力減弱，提示RunX3基因可能參與了髓系細胞的分化過程，并在此過程中可能起抑制作用。

在正常生理狀態(tài)時，RunX3基因?qū)π∈笤煅杉毎€(wěn)態(tài)維持及其分化沒有影響。在移植后的應激狀態(tài)下 RunX3－/－小鼠的骨髓造血干細胞在受體小鼠體內(nèi)的造血重建能力方面沒有顯著差異，但是在應激狀態(tài)下向髓系細胞分化能力增強，而向 B淋巴細胞的分化能力減弱，提示RunX3基因可能參與了骨髓造血干細胞的分化過程。有關 RunX3基因在衰老過程中以及其他病理生理狀態(tài)下對造血干細胞的功能的影響還需要進一步研究。

圖5 骨髓移植后供體來源的外周血細胞中白細胞各亞群所占的比例注:圖A顯示移植后1個月時，供體來源的B淋巴細胞和髓系細胞占總供體外周血細胞的比例;圖B顯示移植后3個月時，供體來源的B淋巴細胞和髓系細胞占總供體外周血細胞的比例;圖C顯示5－FU處理一周時外周血中供體來源的B淋巴細胞和髓系細胞占的比例;圖D顯示5－FU處理一月時外周血中供體來源的B淋巴細胞和髓系細胞占的比例。*:P＜0.05;WT:野生型小鼠;RunX3－/－:RunX3－/－小鼠.Note:(A)Histogram showing the percentage of B lymphocytes or myeloid cells in the donor－derived blood cells at one month after competitive transplantation.(B)Histogram showing the percentage of B lymphocytes or myeloid cells in the donor－derived blood cells at three months after competitive transplantation.(C)Histogram showing the percentage of donor－derived B lymphocytes or myeloid cells blood cells in the donor－derived blood cells at one week after 5－FU treatment.(D)Histogram showing the percentage of donor－derived B lymphocytes or myeloid cells blood cells in the donorderived blood cells at one month after 5－FU treatment.* P＜0.05;WT:wild－type mice;RunX3－/－:RunX3－/－mice.Fig.5 The percentage of leukocyte subsets repopulation in the donor－derived peripheral blood cells

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The Role of RunX3 Gene in Mouse Hematopoietic Stem Cells

YAO Chao，SHI Gui－ying，CHENG Zhi－yang，HUANG Xin，HU Yong－yan，JU Zhen－yu
(Key laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo study the role of RunX3 gene in the self－renewal and differentiation of hematopoietic stem cells(HSC)。MethodsThe number and function of hematopoietic stem cells in RunX3 knockout mice were determined by competitive bone marrow transplantation and flow cytometry。ResultsThe number of bone marrow stem cells in RunX3 knockout mouse was the same as those of wild type control mice.Competitive transplantation revealed no difference of HSC self－renewal in RunX3 knockout mouse，but a putative differentiation bias toward myeloid lineage。ConclusionRunX3 gene is not essential in the HSC self－renewal capacity，but appears to promote the HSC differentiation to myeloid lineage.

RunX3;knockout mice;Hematopoietic stem cells

R34915

A

1671－7856(2010)04－0028－06

2010－01－10

國家自然基金面上項目(30771189);十一五新藥專項支持(2009ZX09501－026)。

姚超(1978－)，研究方向:干細胞、衰老與再生醫(yī)學。

鞠振宇，E－mail:zhenyuju@hotmail.com。