顧紹峰 彭榮梅 肖格格 馮云 洪晶

北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科 眼部神經(jīng)損傷的重建保護與康復(fù)北京市重點實驗室，北京 100191

角膜后彈力層剝除聯(lián)合自動角膜刀取材內(nèi)皮移植術(shù)(Descemet stripping automated endothelial keratoplasty，DSAEK)具有排斥反應(yīng)少、學(xué)習(xí)曲線短、手術(shù)風(fēng)險小、術(shù)后視力恢復(fù)快等優(yōu)點，徹底推動了角膜內(nèi)皮移植手術(shù)在全球的廣泛開展，并取代傳統(tǒng)的穿透角膜移植術(shù)成為目前治療角膜內(nèi)皮疾病的主要方法[1]。然而隨著手術(shù)技術(shù)的日臻成熟，對手術(shù)效果的要求也越來越高。有研究發(fā)現(xiàn)，供體角膜內(nèi)皮移植片越薄，則術(shù)后視力恢復(fù)越好，內(nèi)皮細胞丟失率越低[2-3]。因而在傳統(tǒng)的DSAEK基礎(chǔ)上，發(fā)展出了薄植片手術(shù)方案，如超薄DSAEK[4]。但這一結(jié)論目前仍存在很多爭議，有大量研究發(fā)現(xiàn)供體植片厚度與術(shù)后視力、角膜內(nèi)皮細胞密度(endothelial cell density，ECD)無關(guān)[5-7]，甚至有研究認為薄植片會增加角膜內(nèi)皮細胞的丟失[8]。而中國人的眼部解剖結(jié)構(gòu)與歐美等人群存在明顯差異。國外報道的DSAEK手術(shù)供體植片多為大植片，直徑多為8.5 mm或以上[9]，國內(nèi)DSAEK手術(shù)的供體植片則多為小植片(直徑多為8.0 mm或以下)。而關(guān)于小植片DSAEK手術(shù)移植片厚度和大小對術(shù)后ECD的影響尚未見報道。本研究擬探討國內(nèi)DSAEK術(shù)后2年供體植片的厚度和大小對ECD的影響，為符合國人眼部特點的小植片DSAEK手術(shù)提供研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用系列病例觀察研究，收集2013年1月至2017年12月因角膜內(nèi)皮功能失代償在北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科中心行DSAEK手術(shù)的患者134例144眼，年齡4～88歲，平均(52.2±20.2)歲。其中男65例73眼，女69例71眼；右眼74眼，左眼70眼；術(shù)前平均眼壓(15.4±5.3)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。所有患者均完成2年隨訪且資料完整。導(dǎo)致角膜內(nèi)皮失代償?shù)脑虬‵uchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良14眼、其他類型角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良11眼、白內(nèi)障摘出術(shù)后54眼、抗青光眼術(shù)后19眼、玻璃體切割術(shù)后7眼、角膜移植術(shù)后20眼、眼外傷6眼和其他病因13眼。因術(shù)后3個月角膜供體中央植片厚度(central graft thickness，CGT)基本穩(wěn)定，故根據(jù)術(shù)后3個月CGT將患者分為薄植片組45眼、中等厚植片組66眼和厚植片組33眼，分別為供體CGT<100 μm、≥100～<150 μm和≥150 μm。按照角膜環(huán)鉆切割的供體植片大小分為小植片組31眼和大植片組113眼，供體植片直徑分別為≥7～<8 mm和≥8～<9 mm。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(批文號：IRB00006761-2008025)，所有患者術(shù)前均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1供體ECD檢查 術(shù)前采用角膜內(nèi)皮鏡(HAI EB-3000XYZ，美國HAI Laboratories公司)測量供體ECD。將眼庫標(biāo)準(zhǔn)化處理的供體角膜移植片放入裝有保存液的玻璃瓶中，并放入HAI EB-3000XYZ型內(nèi)皮顯微鏡的固定槽中，調(diào)節(jié)鏡頭位置，使內(nèi)皮細胞顯示清晰，選定50～100個細胞，使用機器自帶內(nèi)皮分析軟件(HAI CAS EB 2.10)對供體角膜ECD進行分析。

1.2.2活體角膜激光掃描共聚焦顯微鏡檢查 術(shù)后1、3、6、12和24個月，采用海德堡活體角膜激光掃描共聚焦顯微鏡(HRT3/RCM，德國Heidelberg公司)測量ECD。放大倍數(shù)為800倍，分辨率為1 μm，觀察視野為380 μm×380 μm。檢查前使用4 g/L鹽酸奧布卡因(日本參天制藥株式會社)對受檢眼進行表面麻醉1次，點用Vidisic眼凝膠(美國博士倫公司)，并蓋上一次性無菌角膜接觸帽。調(diào)整操縱臺高度固定受檢者下頜和前額，調(diào)整物鏡位置，使角膜接觸帽與角膜中央輕微接觸，預(yù)設(shè)其接觸的焦平面深度為0 μm。轉(zhuǎn)動焦平面調(diào)節(jié)環(huán)，獲得不同深度不同層次的圖像。檢查結(jié)束后，選取清晰的圖像存盤。檢查另一眼需換用新的無菌帽。使用設(shè)備自帶軟件對圖像進行分析并計算ECD。根據(jù)術(shù)后不同時間點ECD及其相對應(yīng)的術(shù)前供體ECD，計算角膜內(nèi)皮細胞丟失率，角膜內(nèi)皮細胞丟失率=(術(shù)前供體ECD-術(shù)后ECD)/術(shù)前供體ECD。

1.2.3角膜中央總厚度和供體CGT測量 采用眼前節(jié)光相干斷層掃描儀AS-OCT(Visante OCT，德國Carl Zeiss公司)測量術(shù)前及術(shù)后角膜中央總厚度(central corneal thickness，CCT)和供體CGT。患者下頜置于下頜托上，注視鏡頭內(nèi)的注視目標(biāo)。調(diào)整患者固視角，使視軸與眼軸一致。采用AS-OCT高分辨率角膜模塊進行測量。掃描過程中，單擊瞳孔中央至最佳校準(zhǔn)即可取像，采用設(shè)備自帶軟件對圖像進行分析。將測量光標(biāo)移動至角膜中央位置，坐標(biāo)顯示為(0，0)，測量頂點角膜上皮層至內(nèi)皮層的厚度為CCT。內(nèi)皮移植術(shù)后，供體移植片與受體植床之間存在高反光界面。同樣將測量光標(biāo)移至角膜中央(0，0)位置，測量高反光界面至內(nèi)皮層的厚度即為供體CGT。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件(美國IBM公司)進行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實不符合正態(tài)分布，以M(Q1，Q3)表示。手術(shù)前后各時間點CCT及手術(shù)后各時間點供體CGT總體比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較采用Wilcoxon符號秩檢驗；采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析術(shù)后24個月ECD與術(shù)前供體ECD、CGT及植片大小的關(guān)系；采用Kruskal-WallisH檢驗分析不同厚度植片組術(shù)前供體ECD以及術(shù)后各觀察時間點3個組角膜內(nèi)皮細胞丟失率的差異；采用Mann-WhitneyU檢驗分析不同大小植片組術(shù)前供體ECD、術(shù)后3個月供體CGT以及術(shù)后各觀察時間點角膜內(nèi)皮細胞丟失率的差異。采用雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)前后CCT和手術(shù)后供體CGT比較

術(shù)前及術(shù)后1、3、6、12、24個月CCT分別為797.5(722.5，910.0)、641.5(590.5，730.0)、619.5(577.0，691.5)、625.0(572.5，699.0)、627.0(584.5，692.5)和623.0(578.0，692.0)μm，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=259.008，P<0.001)，其中術(shù)后各時間點CCT明顯薄于術(shù)前，術(shù)后1、3、6、12、24個月的CCT分別與術(shù)前CCT相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

術(shù)后1、3、6、12和24個月供體CGT分別為129.0(90.8，160.8)、115.5(93.0，146.0)、115.5(89.0，151.0)、112.5(94.3，146.8)和114.0(89.0，144.5)μm，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=37.369，P<0.001)，其中術(shù)后1個月供體CGT與術(shù)后3個月相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，術(shù)后3個月供體CGT分別與術(shù)后6個月、12個月、24個月相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

2.2 術(shù)后不同時間點ECD和角膜內(nèi)皮細胞丟失率變化

術(shù)前供體植片ECD為2 455.9(2 250.0，2 872.3)個/mm2，術(shù)后1、3、6、12、24個月ECD逐漸降低，角膜內(nèi)皮細胞丟失率逐漸升高(表1)。

表1 術(shù)后各時間點ECD和角膜內(nèi)皮細胞丟失率[M(Q1,Q3)]Table 1 ECD and endothelial cell loss rate at different time points after the surgery (M[Q1,Q3])時間眼數(shù)ECD(個/mm2)角膜內(nèi)皮細胞丟失率(%)術(shù)后1個月1441 931.5(1 487.5,2 330.0)23.0(13.0,34.4)術(shù)后3個月1441 874.0(1 416.5,2 245.8)25.2(14.7,36.5)術(shù)后6個月1441 803.0(1 385.3,2 199.3)28.7(19.6,42.7)術(shù)后12個月1441 524.5(1 188.3,2 104.0)37.0(23.9,47.1)術(shù)后24個月1441 375.0(1 033.5,1 892.8)45.9(31.3,54.7) 注:ECD:內(nèi)皮細胞密度 Note:ECD:endothelial cell density

2.3 術(shù)后24個月ECD與術(shù)前供體植片ECD、供體植片大小及供體CGT的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，術(shù)后24個月時ECD與術(shù)前供體植片ECD呈強正相關(guān)(rs=0.783，P<0.001)，與供體植片大小和術(shù)后3個月時的供體CGT均無明顯相關(guān)性(rs=0.141，P=0.093；rs=-0.044，P=0.600)(圖1)。

圖1 術(shù)后24個月ECD與術(shù)前供體植片ECD、植片大小及供體CGT的相關(guān)性(Spearman相關(guān)分析，n=144) A：術(shù)后24個月ECD與術(shù)前供體植片ECD呈強正相關(guān)(rs=0.783，P<0.001) B：術(shù)后24個月ECD與供體植片大小無明顯相關(guān)性(rs=0.141，P=0.093) C：術(shù)后24個月ECD與術(shù)后3個月時供體CGT無明顯相關(guān)性(rs=-0.044，P=0.600) ECD：內(nèi)皮細胞密度；CGT：中央植片厚度Figure 1 Correlations between 24-month postoperative ECD and donor graft ECD,donor graft size and donor CGT (Spearman correlation analysis,n=144) A:ECD at postoperatively 24 months was strongly positively correlated with the donor ECD (rs=0.783,P<0.001) B:There was no correlation between donor graft size and the 24-month postoperative ECD (rs=0.141,P=0.093) C:The 24-month postoperative ECD was not associated with donor CGT at postoperatively 3 months (rs=-0.044,P=0.600) ECD:endothelial cell density;CGT:central graft thickness

2.4 不同厚度供體CGT組術(shù)前ECD和術(shù)后角膜內(nèi)皮細胞丟失率比較

薄植片組、中等厚植片組和厚植片組供體CGT分別為72.0(62.0，89.5)、118.5(111.8，135.3)和171.0(164.0，209.0)μm。3個組術(shù)前ECD分別為2 499.8(2 251.1，3 033.0)、2 458.5(2 250.0，3 013.0)和2 424.0(2 254.9，2 713.9)個/mm2，總體比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(H=0.368、P=0.832)。3個組術(shù)后各時間點角膜內(nèi)皮細胞丟失率總體比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 不同厚度供體CGT組術(shù)后各時間點角膜內(nèi)皮細胞丟失率比較[M(Q1,Q3),%]Table 2 Comparison of endothelial cell loss rate among three groups at different time point after the surgery (M[Q1,Q3],%)組別眼數(shù)術(shù)后1個月術(shù)后3個月術(shù)后6個月術(shù)后12個月術(shù)后24個月薄植片組4524.6(13.0,38.1)28.1(15.9,41.7)28.0(17.1,42.0)34.3(19.6,47.4)40.8(31.3,55.5)中等厚植片組6622.4(13.8,31.4)21.3(12.3,31.1)28.4(21.1,41.7)36.8(25.0,44.3)47.3(31.6,54.0)厚植片組3324.1(12.4,40.3)31.0(17.8,39.3)30.2(16.0,43.9)41.5(16.6,53.6)49.1(30.1,54.8)H值1.6304.4050.2331.1840.079P值0.4430.1110.8900.5530.961 注:(Kruskal-Wallis H檢驗) CGT:中央植片厚度 Note:(Kruskal-Wallis H test) CGT:central graft thickness

2.5 不同供體植片大小組術(shù)前ECD、術(shù)后供體CGT及角膜內(nèi)皮細胞丟失率比較

小植片組和大植片組植片直徑分別為7.5(7.5，7.5)mm和8.0(8.0，8.0)mm。2個組術(shù)前ECD和術(shù)后3個月時供體CGT比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.002、-1.648，均P>0.05)(表3)。2個組術(shù)后各時間點角膜內(nèi)皮細胞丟失率總體比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表4)。

表3 不同供體植片大小組術(shù)前ECD和術(shù)后CGT比較[M(Q1,Q3)]Table 3 Comparison of preoperative ECD and postoperative CGT between two groups (M[Q1,Q3])組別眼數(shù)術(shù)前ECD(個/mm2)術(shù)后3個月CGT(μm)小植片組312 329.5(2 252.3,3 033.0)107.0(88.0,139.0)大植片組1132 490.0(2 250.0,2 765.6)117.0(93.0,151.5)Z值-0.002-1.648P值0.9980.099 注:(Mann-Whitney U檢驗) ECD:內(nèi)皮細胞密度;CGT:中央植片厚度 Note:(Mann-Whitney U test) ECD:endothelial cell density;CGT:central graft thickness

表4 不同供體植片大小組術(shù)后各時間點角膜內(nèi)皮細胞丟失率比較[M(Q1,Q3),%]Table 4 Comparison of endothelial cell loss rate between two groups at different time points after the surgery (M[Q1,Q3],%)組別眼數(shù)術(shù)后1個月術(shù)后3個月術(shù)后6個月術(shù)后12個月術(shù)后24個月小植片組3119.7(11.5,29.6)23.5(12.9,31.5)30.9(20.9,43.7)41.4(24.4,52.2)49.0(36.3,57.2)大植片組11323.9(13.4,35.4)27.1(15.5,36.8)28.0(18.8,41.3)35.7(21.9,45.3)45.4(30.0,54.2)Z值-1.091-0.770-0.911-1.429-1.726P值0.2750.4410.3620.1530.084 注:(Mann-Whitney U檢驗) Note:(Mann-Whitney U test)

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)DSAEK術(shù)前，供體植片會產(chǎn)生“水腫”，其主要原因是供體角膜在進行切削時，植片浸泡于平衡鹽溶液中，并去除了角膜上皮層。而術(shù)后供體植片會發(fā)生“去水腫”作用，從而使其厚度變薄[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，DSAEK術(shù)后1個月和3個月，CCT和供體CGT均明顯降低，3個月以后逐漸趨于穩(wěn)定。這表明DSAEK術(shù)后3個月時，植床與植片的炎癥反應(yīng)基本消退，而植片內(nèi)皮細胞的術(shù)源性損傷也趨于停止，ECD和功能趨于穩(wěn)定，從而使植床和植片的厚度基本穩(wěn)定。Di Pascuale等[11]研究發(fā)現(xiàn)，DSAEK術(shù)后供體植片厚度變薄，可從術(shù)后第1天的243 μm降至末次隨訪的148 μm。本研究也發(fā)現(xiàn)，供體CGT從術(shù)后1個月的129.0(90.8，160.8)μm降至術(shù)后3個月的115.5(93.0，146.0)μm。這一結(jié)果提示我們，DASEK術(shù)后供體植片會產(chǎn)生“去水腫”作用，因而術(shù)前準(zhǔn)備供體移植片及評價手術(shù)療效時，應(yīng)注意供體移植片厚度的變化。如術(shù)前植片厚度大于100 μm，術(shù)后植片厚度變薄，可能使原來的DSAEK變成超薄DSAEK。

通過上述分析，本研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后3個月時供體CGT基本穩(wěn)定，故選取術(shù)后3個月的供體CGT分析DSAEK術(shù)后24個月ECD與術(shù)前供體植片ECD、供體植片大小和供體CGT的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)術(shù)后24個月ECD與術(shù)前供體ECD呈強正相關(guān)，而與供體植片大小和供體CGT無明顯相關(guān)性，這一結(jié)果與既往的一些研究結(jié)論相同。Lass等[12]研究發(fā)現(xiàn)，DSAEK術(shù)后3年ECD與術(shù)前供體ECD呈正相關(guān)，而與供體植片厚度無明顯相關(guān)性。而Lekhanont等[13]的研究也認為DSAEK術(shù)后5年的ECD與術(shù)前供體ECD呈正相關(guān)，而與供體植片的直徑不相關(guān)。

2012年，Busin等[14]進行的超薄DSAEK手術(shù)中所用供體植片厚度均小于100 μm，此后陸續(xù)很多研究發(fā)現(xiàn)，超薄DSAEK具有視力恢復(fù)快、術(shù)后高階相差小等優(yōu)點[15-16]，但供體CGT與DSAEK術(shù)后視力恢復(fù)關(guān)系仍存在一定爭議[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在隨訪的24個月內(nèi)，厚植片組的角膜內(nèi)皮細胞丟失率一直較高，僅術(shù)后1個月時低于薄植片組。術(shù)后3個月內(nèi)薄植片組內(nèi)皮細胞丟失率較高，可能與薄植片在DSAEK手術(shù)時展開困難、操作相對復(fù)雜有關(guān)；而術(shù)后6～24個月薄植片組的內(nèi)皮細胞丟失率低于其他2個組，可能與術(shù)后3個月后植片穩(wěn)定、薄植片的角膜基質(zhì)含量少、炎癥反應(yīng)和排斥反應(yīng)較輕以及損傷的內(nèi)皮細胞恢復(fù)較快有關(guān)。厚植片組的角膜內(nèi)皮細胞丟失率一直較高，考慮與手術(shù)過程中厚植片通過角膜切口進入前房時，角膜切口及植入器端口對內(nèi)皮細胞的雙重擠壓作用，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷相對較多有關(guān)；且其植片較厚，術(shù)后炎癥和排斥反應(yīng)相對嚴重，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷恢復(fù)不佳。但術(shù)后各觀察時間點，3個組之間角膜內(nèi)皮細胞丟失率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。因此我們認為在DSAEK手術(shù)中，相對薄的供體植片術(shù)后角膜內(nèi)皮細胞損失較小，內(nèi)皮細胞丟失率可能較低。

本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)前小植片組和大植片組間ECD以及術(shù)后3個月時供體CGT的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后1～3個月，小植片組的角膜內(nèi)皮細胞丟失率低于大植片組，考慮與大植片通過角膜切口時，因切口對內(nèi)皮細胞的擠壓作用，引起更多的角膜內(nèi)皮細胞損傷有關(guān)；而術(shù)后6～24個月，大植片組的角膜內(nèi)皮細胞丟失率低于小植片組，考慮可能與大植片含有更多的角膜內(nèi)皮細胞及部分損傷的內(nèi)皮細胞功能逐漸恢復(fù)有關(guān)。但術(shù)后各觀察時間點，2個組之間角膜內(nèi)皮細胞丟失率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。因此我們認為在DSAKE手術(shù)中，相對大的供體植片術(shù)后內(nèi)皮細胞損失較小，內(nèi)皮細胞丟失率可能較低。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示符合國人特點的小植片DSAEK手術(shù)在術(shù)后3個月時供體CGT趨于穩(wěn)定。術(shù)后24個月，ECD與術(shù)前供體ECD呈強正相關(guān)，而與供體CGT和植片大小無明顯相關(guān)性。供體植片越薄、直徑越大，術(shù)后遠期角膜內(nèi)皮細胞丟失率越低，更有利于植片的長期存活。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明顧紹峰：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析、論文撰寫；彭榮梅：采集數(shù)據(jù)、分析數(shù)據(jù)；肖格格、馮云：臨床信息的分析和解釋；洪晶：研究指導(dǎo)、論文修改及定稿