戴敏 亢澤峰 胡竹林 李妍

1云南大學(xué)附屬醫(yī)院眼科 云南省眼科醫(yī)院 云南省眼科研究所 云南省眼科疾病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省第二人民醫(yī)院白內(nèi)障與眼底疾病防治省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 云南省姚克專(zhuān)家工作站 云南省眼部疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 云南省眼科疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，昆明 650021；2中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京 100040

青光眼是世界上主要的致盲眼病，可導(dǎo)致視盤(pán)凹陷性萎縮和視野缺損，研究表明病理性眼壓升高是其主要危險(xiǎn)因素[1]。青光眼可引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡，導(dǎo)致視功能不可逆損害。RGCs的病理改變和凋亡機(jī)制在青光眼的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，RGCs的丟失率可以更好地評(píng)估青光眼進(jìn)展[2]。如果能夠找到有效的方法保護(hù)RGCs或促進(jìn)其再生，對(duì)于青光眼的治療具有重要意義。既往認(rèn)為，成年哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜損傷后無(wú)再生和修復(fù)能力。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，成年哺乳動(dòng)物眼中存在未分化的視網(wǎng)膜干細(xì)胞(retinal stem cells，RSCs)。Ahmad等[3]首先從成年E17大鼠的視網(wǎng)膜中分離出RSCs，其顯示出許多神經(jīng)干細(xì)胞的特征：(1)可以增生，并表達(dá)神經(jīng)外胚層標(biāo)志物巢蛋白(Nestin)及視網(wǎng)膜細(xì)胞胚胎發(fā)育階段的特異性標(biāo)志物Chx-10；(2)具有多能性；(3)可以自我更新[3-5]。這些干細(xì)胞可以在一定條件下被激活和分化，修復(fù)受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)元[6]。然而，RSCs的定向誘導(dǎo)分化機(jī)制十分復(fù)雜，主要受細(xì)胞外微環(huán)境因素和內(nèi)在細(xì)胞因子的共同調(diào)控。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠RGCs的條件培養(yǎng)基增加了大鼠RSCs向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞的分化，并且在一定壓力范圍內(nèi)分化程度隨著周?chē)鷫毫Φ纳叨黾覽7]。為了進(jìn)一步揭示壓力對(duì)與RGCs共培養(yǎng)的RSCs分化的影響，本研究擬探討在壓力升高的情況下，RSCs與RGCs共培養(yǎng)是否能夠促進(jìn)RSCs分化為神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)新生新西蘭大白兔及孕22 d兔6～8只[昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(滇)K2015-0002]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。本研究經(jīng)云南大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào)：KPRC-IACUC17008)。

1.1.2主要試劑及儀器 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM/F12(含B27、N2、肝素、谷氨酰胺)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；上皮生長(zhǎng)因子(epithelial growth factor，EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(美國(guó)Sigma公司)；免疫熒光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；溴脫氧核苷尿嘧啶(bromodeoxyuridine，BrdU)細(xì)胞增生檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；RNA提取試劑盒、RT-qPCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；Transwell培養(yǎng)皿(美國(guó)Corning公司)；小鼠抗Nestin抗體(sc-23927)、小鼠抗Brn3b抗體(sc-514474)、小鼠抗Thy1.1抗體(sc-19614)、小鼠抗GS抗體(sc-74430)、小鼠抗GAPDH抗體(sc-47724)(美國(guó)Santa Cruz公司)；iFluor 488標(biāo)記羊抗小鼠二抗(16735，美國(guó)AAT Bioquest公司)；羊抗小鼠二抗(ab6789，英國(guó)Abcam公司)。解剖顯微鏡(S9)、熒光顯微鏡(Mica，德國(guó)Leica公司)；離心機(jī)(LC-LX-HLR250D，上海力辰儀器科技有限公司)；血壓計(jì)(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備及用品有限公司)；CO2培養(yǎng)箱、PCR儀(Step One Plus)(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1兔RSCs和RGCs的培養(yǎng)及鑒定

1.2.1.1兔RSCs的培養(yǎng) 取孕齡22 d新西蘭大白兔，耳緣靜脈注入空氣處死，取出胚胎6～8只。在解剖顯微鏡下取出視網(wǎng)膜睫狀緣色素上皮組織，用剪刀剪成糜狀，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%胰蛋白酶37 ℃消化10 min，終止消化，加入0.01 g/L DNA酶，反復(fù)輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，離心半徑21 cm，1 500 r/min離心5 min，棄上清，用含EGF和bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸沉淀，過(guò)200 μm篩網(wǎng)，接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后每3天半量換液，每5～7天傳代1次，傳至第3～4代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.2免疫熒光法及流式細(xì)胞術(shù)鑒定兔RSCs (1)Nestin免疫熒光染色鑒定 采用Nestin抗體(1∶ 200)檢測(cè)培養(yǎng)的RSCs，按免疫熒光試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，Nestin呈綠色熒光，細(xì)胞核均采用DAPI染色，呈藍(lán)色；(2)BrdU流式細(xì)胞術(shù)分析 參照BrdU細(xì)胞增生檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，在兔RSCs的培養(yǎng)體系中加入BrdU至終濃度為50 μmol/L，孵育24 h。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、通透和DNA變性處理后，加入FITC-BrdU抗體5 μl(0.125 μg)進(jìn)行標(biāo)記，4 ℃條件下避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)；(3)RSCs自發(fā)分化細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)及流式細(xì)胞術(shù)分析 將正常培養(yǎng)的兔RSCs放入多聚賴(lài)氨酸包被的培養(yǎng)板中，并換為含體積分?jǐn)?shù)1% B27和1% N2的DMEM/F12分化培養(yǎng)基，每3天換液1次。分化10 d，獲取并重懸細(xì)胞；按免疫熒光試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用Brn3b抗體(1∶ 200)和GS抗體(1∶ 200)檢測(cè)分化所得細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察。分別采用紅色及綠色熒光的二抗對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，采用流式細(xì)胞術(shù)雙色分析檢測(cè)Brn3b陽(yáng)性細(xì)胞及GS陽(yáng)性細(xì)胞在分化細(xì)胞中所占的比例。

1.2.1.3兔RGCs的原代培養(yǎng)及免疫熒光染色法鑒定 取出生1～2 d的新西蘭大白兔6只，頸椎脫臼法處死。無(wú)菌條件下取出眼球，漂洗3次。在顯微鏡下分離出視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層組織。漂洗3次，置于0.5 g/L胰蛋白酶中，37 ℃消化30 min，加入含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM終止消化。40 μm濾網(wǎng)過(guò)濾。離心半徑21 cm，1 500 r/min室溫離心5 min，棄上清，加入DMEM完全培養(yǎng)基。調(diào)整細(xì)胞密度后，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d。獲取細(xì)胞，采用Brn3b抗體(1∶ 200)及Thy1.1抗體(1∶ 200)進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，Brn3b陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，Thy1.1陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光。

1.2.2RSCs與RGCs在不同壓力下共培養(yǎng) RSCs與RGCs置于Transwell培養(yǎng)皿上下層構(gòu)建共培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，接種1×105個(gè)RGC至上室培養(yǎng)皿中，5×105個(gè)RSCs至下室培養(yǎng)皿中。用剪刀將裝有500 ml生理鹽水的袋子底部剪開(kāi)，倒出生理鹽水。將培養(yǎng)皿放入空袋中，并使用塑料信封機(jī)將底部密封。利用血壓計(jì)將空氣泵入袋中，并使用該儀器測(cè)量壓力。使用該方法在37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中以不同壓力(0、20、40、60、80 mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)處理細(xì)胞48 h。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)不同壓力下實(shí)驗(yàn)兔RSCs及分化所得細(xì)胞Nestin和Thy1.1的表達(dá) 采用Trizol提取液提取各組細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將0.5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為42 ℃水浴60 min，70 ℃加熱10 min。將獲得的cDNA模板與實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，引物由上海生工生物有限公司提供。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，以上3步循環(huán)42次。PCR在CFX96 TouchTMreal-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)中完成。以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)各基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

表1 引物序列Figure 1 Primer sequences引物引物序列(5'-3')擴(kuò)增片段長(zhǎng)度(bp)NestinThy1.1GAPDH正向:AAGATGGAGAAACGGT-GACG反向:TCCTGGTTCTCCTTTTGT-GG正向:CATGAGAACAC-CACGAGCGT反向:GTACCTGCTGGTGAAGT-TGGT正向:TGGTGAAGGTCGGAGT-GAAC反向:TGCCGTGGGTGGAAT-CATAC208156135 注:Nestin:巢蛋白;Thy:胸腺嘧啶;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶 Note:Thy:thymine;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase

1.2.4Western blot法檢測(cè)不同壓力下實(shí)驗(yàn)兔RSCs及分化所得細(xì)胞Nestin及Thy1.1的表達(dá) 加入蛋白抽提裂解液充分裂解各組細(xì)胞，進(jìn)行物理超聲后，采用BCA法蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。并采用1倍磷酸鹽緩沖液將蛋白濃縮至5 μg/μl。以40 μg總蛋白/孔上樣，用10%SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫封閉2 h，一抗1∶ 500稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜。內(nèi)參GAPDH抗體1∶ 1 000稀釋。HRP標(biāo)記的二抗1∶ 2 000稀釋?zhuān)覝叵路跤? h。清洗膜后，將其暴露在暗室中并顯影。采用ImageJ軟件分析各條帶灰度值，目的蛋白相對(duì)蛋白表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兔RSCs的培養(yǎng)及鑒定

2.1.1Nestin免疫熒光染色鑒定 分離的兔RSCs聚集成細(xì)胞球形態(tài)，細(xì)胞球內(nèi)大部分細(xì)胞均顯示RSCs特異性標(biāo)志物Nestin陽(yáng)性(圖1)。

圖1 Nestin抗體免疫熒光染色鑒定兔RSCs A：光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)分離的兔RSCs聚集成細(xì)胞球形態(tài)，懸浮于培養(yǎng)基中(×200，標(biāo)尺=200 μm)B：免疫熒光染色鑒定顯示，細(xì)胞球內(nèi)大部分細(xì)胞均顯示Nestin陽(yáng)性，呈綠色熒光，細(xì)胞核均呈DAPI藍(lán)染(FITC ×200，標(biāo)尺=200 μm) Nestin：巢蛋白；DAPI：二脒基苯基吲哚Figure 1 Immunofluorescence staining of nestin antibody to identify rabbit RSCs A：The isolated rabbit RSCs aggregated into cell spheres and suspended in the medium (×200，bar=200 μm) B：Most cells in the cell spheres were nestin-positive and presented green.The nuclei stained with DAPI showed blue (FITC ×200，bar=200 μm) DAPI：diamidine phenylindole

2.1.2兔RSCs增生細(xì)胞數(shù) 流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞占分離的RSCs細(xì)胞的(92.26±3.28)%(圖2)。

圖2 BrdU流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔RSCs增生細(xì)胞數(shù) BrdU陽(yáng)性細(xì)胞率為(92.26±3.28)% A：培養(yǎng)體系中加入BrdU B：培養(yǎng)體系中未加入BrdU FITC：異硫氰酸熒光素；BrdU：溴脫氧核苷尿嘧啶Figure 2 Proliferation of cultured rabbit RSCs detected by BrdU cell proliferation assay kit The percentage of BrdU-positive RSCs was (92.26±3.28)% A：Rabbit RSCs cultured with BrdU B：Rabbit RSCs cultured without BrdU FITC：fluorescein isothiocyanate；BrdU：bromodeoxyuridine

2.1.3RSCs自發(fā)分化所得細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)及流式細(xì)胞術(shù)分析 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，RSCs分化細(xì)胞中，部分細(xì)胞Brn3b抗體表達(dá)陽(yáng)性，部分細(xì)胞GS抗體表達(dá)陽(yáng)性，均呈綠色熒光。流式細(xì)胞術(shù)雙色分析結(jié)果顯示，Brn3b陽(yáng)性細(xì)胞率為(13.00±3.06)%，GS陽(yáng)性細(xì)胞率為(31.60±3.67)%(圖3)。

圖3 RSCs自發(fā)分化細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)及流式細(xì)胞術(shù)分析 A：部分細(xì)胞Brn3b抗體表達(dá)陽(yáng)性，呈綠色熒光(FITC ×200，標(biāo)尺=100 μm) B：部分細(xì)胞GS抗體表達(dá)陽(yáng)性，呈綠色熒光(FITC ×200，標(biāo)尺=100 μm) C：流式細(xì)胞術(shù)雙色分析顯示，Brn3b陽(yáng)性細(xì)胞率為(13.00±3.06)%，GS陽(yáng)性細(xì)胞率為(31.60±3.67)% DAPI：二脒基苯基吲哚Figure 3 Immunofluorescence staining and flow cytometry of spontaneously differentiated rabbit RSCs A：Some cells were Brn3b-positive and showed green fluorescence (FITC ×200，bar=200 μm) B：Some cells were GS-positive and presented green fluorescence (FITC ×200，bar=200 μm) C：Two-color flow cytometry analysis showed that the proportion of Brn3b-positive cells was (13.00±3.06)%，and the proportion of GS-positive cells was (31.60±3.67)% in the differentiated cells DAPI：diamidine phenylindole

2.2 RGCs的培養(yǎng)及鑒定

原代分離的兔RGCs可見(jiàn)多個(gè)樹(shù)突狀突起。大部分培養(yǎng)的細(xì)胞Brn-3b及Thy1.1抗體染色陽(yáng)性(圖4)。

圖4 RGCs的培養(yǎng)及鑒定(FITC ×200，標(biāo)尺=100 μm) 體外培養(yǎng)的兔RGCs可見(jiàn)多個(gè)樹(shù)突狀突起，大部分培養(yǎng)的細(xì)胞Brn3b抗體(細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光)和Thy1.1抗體(細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光)染色陽(yáng)性 Thy：胸腺嘧啶Figure 4 Culture and identification of RGCs (FITC ×200，bar=200 μm) Multiple dendritic protrusions could be seen in rabbit RGCs cultured in vitro，and most cells were Brn3b-positive showing green fluorescence in the nucleus，and the Thy1.1-positive showing green fluorescence in the nucleus and cytoplasm Thy：thymine

2.3 不同壓力條件RSCs及分化所得細(xì)胞Nestin和Thy1.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

不同壓力條件下室RSCs及分化所得細(xì)胞的Nestin和Thy1.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=127.600，P=0.005；F=137.400，P<0.001)，其中與0 mmHg組相比，20、40、60、80 mmHg條件下Nestin mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，Thy1.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。40 mmHg時(shí)，Nestin mRNA相對(duì)表達(dá)量最低，Thy1.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量最高(表2)。

表2 不同壓力條件RSCs及分化所得細(xì)胞Nestin和Thy1.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 2 Comparison of relative expressions of nestin andThy1.1 mRNA in RSCs and differentiated cells amongdifferent pressures (x±s)壓力(mmHg)樣本量Nestin mRNA相對(duì)表達(dá)量Thy1.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量0 31.003±0.0551.003±0.0852030.490±0.035a3.833±0.280a4030.257±0.015a5.330±0.455a6030.550±0.026a2.277±0.211a8030.650±0.066a1.360±0.135aF值127.600137.400P值0.005<0.001 注:與0 mmHg相比,aP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) RSCs:視網(wǎng)膜干細(xì)胞;Nestin:巢蛋白;Thy:胸腺嘧啶 1 mmHg=0.133 kPa Note:Compared with 0 mmHg,aP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) RSCs:retinal stem cells;Thy:thymine 1 mmHg=0.133 kPa

2.4 不同壓力條件RSCs及分化所得細(xì)胞Nestin和Thy1.1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

隨壓力升高，Nestin蛋白表達(dá)條帶減弱，40 mmHg時(shí)最弱，Thy1.1蛋白表達(dá)條帶增強(qiáng)，40 mmHg時(shí)最強(qiáng)(圖5)。不同壓力條件下室RSCs及分化所得細(xì)胞Nestin和Thy1.1蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=82.480、158.700，均P<0.001)，其中與0 mmHg相比，20、40、60、80 mmHg條件下Nestin蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Thy1.1蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。40 mmHg時(shí)，Nestin蛋白相對(duì)表達(dá)量最低，Thy1.1蛋白相對(duì)表達(dá)量最高(表3)。

圖5 不同壓力條件RSCs及分化所得細(xì)胞Nestin和Thy1.1蛋白表達(dá)電泳圖 隨壓力升高，Nestin蛋白表達(dá)條帶減弱，40 mmHg時(shí)最弱，Thy1.1蛋白表達(dá)條帶增強(qiáng)，40 mmHg時(shí)最強(qiáng) Nestin：巢蛋白；Thy：胸腺嘧啶；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶 1 mmHg=0.133 kPaFigure 5 Expression of nestin and Thy1.1 proteins in RSCs and differentiated cells under different pressures detected by Western blot As the pressure increased，the nestin protein bands were weakened，and the Thy1.1 protein bands were strengthened.When the pressure was 40 mmHg，the nestin protein band was the weakest，and the Thy1.1 protein band was the strongest Thy：thymine;GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 mmHg=0.133 kPa

表3 不同壓力條件RSCs及分化所得細(xì)胞Nestin和Thy1.1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 3 Comparison of relative expression of nestin andThy1.1 proteins in RSCs and differentiated cells amongdifferent pressures (x±s)壓力(mmHg)樣本量Nestin蛋白相對(duì)表達(dá)量Thy1.1蛋白相對(duì)表達(dá)量031.020±0.0850.420±0.0502030.580±0.030a0.807±0.038a4030.293±0.052a1.303±0.087a6030.450±0.035a0.828±0.074a8030.653±0.099a0.672±0.111aF值82.480158.700P值<0.001<0.001 注:與0 mmHg相比,aP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) RSCs:視網(wǎng)膜干細(xì)胞;Nestin:巢蛋白;Thy:胸腺嘧啶 1 mmHg=0.133 kPa Note:Compared with 0 mmHg,aP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test)RSCs:retinal stem cells;Thy:thymine 1 mmHg=0.133 kPa

3 討論

近年來(lái)，干細(xì)胞成為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞再生研究的一種新趨勢(shì)[8-10]。根據(jù)移植細(xì)胞的來(lái)源不同分為2種：(1)眼組織干細(xì)胞，包括視網(wǎng)膜神經(jīng)干細(xì)胞、視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞去分化的前體細(xì)胞；(2)非眼組織干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、腦源性神經(jīng)干細(xì)胞，及近年展開(kāi)研究的脂肪干細(xì)胞[11-13]。1998年，Reh等[14]提出哺乳動(dòng)物睫狀體色素上皮中可能存在RSCs，多年來(lái)，RSCs已成為細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜病變的研究重點(diǎn)。RSCs是具有自我更新能力和多方向分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞，其可分化為多種視網(wǎng)膜細(xì)胞，表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物[15]。本研究從孕齡22 d的孕兔胚胎中分離了RSCs進(jìn)行原代培養(yǎng)，分離的兔RSCs聚集成細(xì)胞球形態(tài)，可以傳代多次，傳代后對(duì)新細(xì)胞球進(jìn)行鑒定，仍然表達(dá)Nestin，表明這些細(xì)胞具有神經(jīng)干細(xì)胞特性。采用BrdU流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的兔RSCs在體外具有良好的增生能力，同時(shí)進(jìn)行自發(fā)分化鑒定，發(fā)現(xiàn)部分兔RSCs分化為神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，表明本研究成功分離得到兔RSCs。

既往研究表明，視網(wǎng)膜損傷可能會(huì)刺激RSCs自我修復(fù)的潛力[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞抗原可在人胚胎的視網(wǎng)膜部分表達(dá)10～13周，并且可以在體外分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞[18]。Aoki等[19]已將RSCs應(yīng)用于視網(wǎng)膜損傷的治療。Huang等[20]從胚胎大鼠分離出RSCs，移植到視神經(jīng)損傷大鼠左眼視網(wǎng)膜下腔后，植入的細(xì)胞可以遷移并整合到視網(wǎng)膜中，甚至可以分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞。本研究在體外構(gòu)建了RSCs和RGCs的共培養(yǎng)體系，使用一種簡(jiǎn)單的方式施加外周壓力，通過(guò)壓力計(jì)保證量化和壓力的重復(fù)性，模擬眼壓升高時(shí)壓力對(duì)與RGCs共培養(yǎng)的RSCs分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著壓力的升高，RSCs中Nestin表達(dá)水平下降，說(shuō)明RSCs分化增多。分化所得細(xì)胞中RGCs的標(biāo)志物Thy1.1表達(dá)逐漸增多，40 mmHg時(shí)RSCs分化程度最大，Nestin mRNA及蛋白表達(dá)量最低，分化所得細(xì)胞中Thy1.1 mRNA及蛋白表達(dá)量最高。但當(dāng)壓力超過(guò)40 mmHg時(shí)，分化細(xì)胞Thy1.1 mRNA及蛋白表達(dá)逐漸減少。這表明壓力升高會(huì)誘導(dǎo)RSCs分化為神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞。然而，長(zhǎng)期或過(guò)高的壓力不僅會(huì)對(duì)RGCs造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，還會(huì)損害RSCs，使其分化能力下降。說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，壓力能夠促進(jìn)與RGCs共培養(yǎng)的RSCs分化，壓力過(guò)大會(huì)損害RSCs并抑制其分化。然而，分化所得的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞雖然能夠表達(dá)RGCs的特異基因，但是否具備RGCs的功能以及在青光眼模型中RSCs移植中具體將會(huì)發(fā)生何種作用，都值得我們進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明，在一定壓力范圍內(nèi)，壓力能夠促進(jìn)與RGCs共培養(yǎng)的RSCs分化為神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞，壓力過(guò)大會(huì)損害RSCs并抑制其分化。如果能夠通過(guò)移植RSCs，促進(jìn)其向有功能的RGCs分化，補(bǔ)充缺失的RGCs，同時(shí)修復(fù)視網(wǎng)膜功能，這將給青光眼未來(lái)的治療帶來(lái)希望。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明戴敏：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫(xiě)、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)分析；亢澤峰：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、論文修改及定稿；胡竹林：論文修改；李妍：部分實(shí)驗(yàn)操作