周文偉，劉月環(huán)

(浙江省醫(yī)學科學院 浙江省實驗動物中心 浙江省實驗動物質量監(jiān)督檢測站，杭州 310013)

調查報告

實驗兔出血癥病毒檢測方法的建立與免疫效果調查

周文偉，劉月環(huán)

(浙江省醫(yī)學科學院 浙江省實驗動物中心 浙江省實驗動物質量監(jiān)督檢測站，杭州 310013)

目的檢測全省六個實驗兔場的兔子所攜帶的兔出血癥病毒(RHDV)情況，調查實驗兔RHDV抗體水平，評價不同疫苗的免疫效果，比較HAI與ELISA兩種方法的符合率。方法采用HAI、ELISA方法對1168份實驗兔RHDV抗體進行了檢測，并與RT－PCR方法的檢測結果進行對比分析。結果我省實驗兔免疫情況較好，不同飼養(yǎng)場的實驗兔免疫合格率雖有不同，但未發(fā)生疫情。通過比較發(fā)現(xiàn)ELISA法檢測的抗體合格率明顯高于HAI法。結論LISA、HAI和RT－PCR方法均適合實驗兔RHDV的檢測。

兔出血癥病毒(RHDV);血凝抑制實驗(HAI);酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA);反轉錄聚合酶鏈式擴增(RT－PCR)

自1984年兔瘟疫情首次報道以來，該病幾乎波及全國所有的養(yǎng)兔地區(qū)。就浙江省而言，兔瘟疫情也一直沒有中斷過。在早期的研究中，人們主要集中于兔瘟的臨床診斷、治療、流行病學調查和組織滅活疫苗研究等方面。查明了該病的病原，初步弄清了RHDV發(fā)病特點，揭示了流行病學規(guī)律［1］。在疫病防控方面，由于沒有找到合適的細胞系，一直沒有被研制出細胞滅活苗，減毒疫苗株也無法進行馴化。因此，兔瘟疫苗的制備主要依賴于發(fā)病兔組織的滅活。這種疫苗雖然很有效，但是生產安全難以保證，時刻存在散毒的危險，生產成本也高。動物疫情月報顯示，近年來，我省每年都有數(shù)十起兔瘟疫情的發(fā)生，給養(yǎng)兔業(yè)構成巨大威脅。兔瘟病毒是一種RNA病毒，迄今該病毒是否發(fā)生了遺傳基因的變異?若有，則這些進化性變異對病毒的致病性和流行病學有什么影響?當前使用的兔瘟疫苗和防控措施是否仍然有效等，一直是懸而未決的問題。

根據(jù)浙江省科技廳關于“十一五”醫(yī)藥行業(yè)及實驗動物行業(yè)的發(fā)展與規(guī)劃，為確保我省醫(yī)藥業(yè)實驗兔質量，我們開展了兔出血癥病毒(RHDV)血清學檢測方法的研究，采用HAI、ELISA方法對從六個實驗兔生產基地獲得的1168份兔血清進行兔出血癥病毒檢測。同時用RT－PCR方法對上述樣品的全血進行RHDV檢測，比較HAI與ELISA兩種方法檢測結果的符合率。

1 材料和方法

1.1 血凝抑制實驗(HAI)

依據(jù) GB/T14926.21－2008，GB/T14926.54－2001中的方法。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

1.2.1 試劑盒的制備:采用 pET表達系統(tǒng)高效表達的RHDV衣殼蛋白氨基端高抗原指數(shù)區(qū)作為抗原包被可拆96孔酶標板，以辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG制備100倍濃縮酶結合物工作液，以間接ELISA法直接檢測兔血清樣品中的 RHDV抗體。樣品稀釋液為含吐溫 －20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4);10×濃縮洗滌液為含吐溫－20的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4);100×濃縮底物貯存液為含四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的二甲基亞砜(DMSO)溶液;底物緩沖液為含過氧化氫的檸檬酸—磷酸鹽緩沖液;終止液為 2 mol/L硫酸溶液。陽性對照為經(jīng)RHDV組織滅活疫苗免疫新西蘭兔獲得的高免陽性血清;陰性對照為非RHDV免疫兔經(jīng)篩選獲得的血清。在進行精密性、特異性、重復性、穩(wěn)定性、敏感性等ELISA法常規(guī)指數(shù)測試后組裝。

1.2.2 檢測步驟:(1)將10×濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍即為洗滌液和酶標二抗稀釋液;(2)將待檢血清用樣品稀釋液作1∶100稀釋，按100 μL/孔加入抗體檢測板中，同時設空白(只加100 μL樣品稀釋液)、陰性對照和陽性對照每孔各 100 μL，37°C孵育45 min，甩干;(3)每孔加洗滌液200 μL，洗滌3次，每次間隔1 min，拍干;(4)用洗滌液將100×濃縮酶標二抗貯存液稀釋 100倍至工作濃度，每孔加100 μL，37℃孵育45 min，甩干;(5)每孔加洗滌液200 μL，洗滌3次，每次間隔1 min，拍干; (6)用底物緩沖液將100×濃縮底物貯存液稀釋100倍至工作濃度，每孔加 100 μL，37℃避光孵育10 min;(7)加50 μL終止液，用酶標儀在450 nm波長下讀取每孔光吸收值(A450 nm值)。

1.2.3 判定標準:在陽性對照孔 A450＞0.5，陰性對照孔A450＜0.2的前提下，樣品孔A450/陰性對照孔A450≥2.1判定為陽性，樣品孔本身 A值 ＞0.2，反之為陰性。如果陽性對照孔A450＜0.5，或陰性對照孔A450＞0.2，表明試劑盒失效或檢測操作有誤，需重新檢測。

1.3 RT-PCR方法 見參考文獻［2］

1.4 樣品

1168份兔血樣來源于浙江省六個實驗兔場(標為Y，P，S，J，N，L)。采樣方式主要是兔耳動脈血2 mL，均分為抗凝和不抗凝兩種，其中抗凝血用于RT－PCR法活體檢測 RHDV病毒，不抗凝血用于HAI法和ELISA法檢測樣品RHDV疫苗免疫抗體效價。各場的數(shù)量分別是L場70份、S場316份、P場415份、Y場221份、J場64份、N場82份。

2 結果與分析

2.1 六個實驗兔場實驗兔RHDV血清抗體檢測

見表1，2，3。

表1 HAI法檢測RHDV血清抗體結果Tab.1 RHDV－positive cases detected by HAI

表2 ELISA法檢測RHDV血清抗體情況Tab.2 RHDV－postive cases detected by ELISA

表3 HAI法與ELISA法檢測RHDV抗體結果Tab.3 The coincidence rate of RHDV detection by HAI and ELISA

2.2 兩種檢測方法的比較

對HAI與 ELISA兩種檢測方法進行了 Kappa檢測，結果見表4、表5。

表4 HAI與ELISA兩種檢測方法年度比較Tab.4 Analysis of the effect of sampling time on RHDV detection using kappa test

從數(shù)據(jù)可以看出，我省的實驗兔免疫情況較好，各場的合格率雖有不同，但結果良好。通過對兩種方法的比較中，我們可以看出ELISA法檢測結果的合格率明顯高于HAI法。Kappa值(P＜0.01)在年度的比較中分別為0.77、0.783、0.828、0.696，在場間的比較中分別是J場0.775、L場0.959、N場0.864、P場0.838、S場0.829和Y場0.71。年度間檢測結果的一致性較好，場內年度間檢測結果的一致性較高，說明該方法較為可靠。HAI雖然價格低廉，但操作復雜，結果的判定與觀察者的經(jīng)驗有很大關系，而ELISA與其相比有明顯的優(yōu)勢，操作過程簡單化，結果可以用儀器精確測定，準確性高，適用于實驗室大規(guī)模的病毒檢測。國外研究表明ELISA比 HAI的假陽性率要低。［3］該法通常以抗RHDV的多克隆血清或針對RHDV衣殼蛋白上不同表位的單克隆抗體包被ELISA板進行檢測，并可用于病毒抗原特性的研究。

在檢測的1168份實驗兔全血中，可疑樣品有14份，分別是L場2、S場2、P場5只、Y場4只、N場1只，都在非免兔中，用 HAI進行驗證性檢測表明，3個是陰性;14個PCR陽性樣品中有10個HAI是陽性，3個陰性。檢測敏感度達100%，特異性為99.12%，經(jīng)統(tǒng)計檢驗，kappa=0.865，表明RT－PCR檢出RHDV的結果與HAI高度一致。上述14個可疑樣分布在 5個場中，進一步跟蹤，未發(fā)現(xiàn)兔場疫情。

3 討論

表5 HAI與ELISA兩種檢測方法兔場之間比較Tab.5 Analysis of the effect of HAI and RHDV detection among different farms by kappa test

根據(jù)GB14922.2－2008，兔出血癥病毒(RHDV)是普通級實驗兔必檢項目，實驗兔免疫后的抗體水平需達到保護效價才算合格。同時，規(guī)定了抗體水平檢測方法為血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HAI)，病原檢測采用RT－PCR法。前二種方法均耗時長，對樣品處理的方法和檢驗人員技術經(jīng)驗要求高，特別是紅細胞難以長期保存。RT－PCR作為一種分子生物學技術現(xiàn)在已被廣泛地用于檢測各種病原微生物和寄生蟲，近年來我國實驗動物界也有將此項技術用于科研項目中的病原體檢測的一種探索，雖然該項技術還不是國標規(guī)定的首選檢測方法，但由于其直接檢測病原體的遺傳物質，具有特異性好，敏感性強，便于自動化分析，省時等優(yōu)點，成為今后檢測病原體的一種主流方法。

間接ELISA法作為一種易于標準化的檢測方法，主要通過基于該法生產的試劑盒及酶標儀來實現(xiàn)，檢測用的試劑盒由包被抗原的96孔板，陰、陽性血清對照，酶標二抗，底物及底物緩沖液，終止液，稀釋液及封板膜組成，該方法是目前實驗動物質量控制中普遍使用的方法。由于兔出血癥病毒一直沒有高純化的抗原，從而ELISA法檢測試劑盒的生產曾經(jīng)是難題。本研究在前期研究中已表達的蛋白研制出ELISA檢測試劑盒，為給我省制訂全面而有效的實驗兔RHD防治措施提供理論依據(jù)和檢測方法支持，同時本課題實施后的兔 RHDV抗體ELISA法檢測試劑盒，已送全國九個省、市、自治區(qū)試用，結果大都反應良好。

該病爆發(fā)后的早期，我國曾有報道認為因兔出血癥疫苗均是組織滅活苗，個別批次確有因滅活不徹底而導致有些兔場在疫苗免疫后3～10 d或半月左右出現(xiàn)動物死亡現(xiàn)象，有些聯(lián)苗(兔瘟、巴桿二聯(lián))因單苗之間質量不好，造成免疫失敗。但隨著制苗技術的成熟，無論單苗還是聯(lián)苗，有相同的免疫效果.聯(lián)苗(兔瘟、巴桿二聯(lián))品種間沒有干擾作用，并且巴桿為革蘭氏陰性小桿菌，其免疫活性質多糖等成分具有優(yōu)劑效應［4］。疫苗的貯存，一般認為在(2～8)℃時可保存半年，25℃以下可保存半個月。疫苗的效價小于24時，會導致免疫失敗。調查中了解到，全省六個實驗兔基地(場)中，S場、N場和L場使用的是浙江省農科院自制的兔瘟、巴桿二聯(lián)疫苗;J場和P場(2007年)使用的是南京天邦生物科技有限公司生產的兔病毒性出血癥單聯(lián)滅活疫苗;Y場和P場(2008年)使用的是齊魯動物保健品公司生產的兔出血癥滅活疫苗。采用 ELISA為比較基準，這幾個兔場的免疫合格率都達到70%以上，免疫方式上都是30～60日齡初免，均是頸部皮下注射，所不同是二免情況，各場根據(jù)存欄時間長短安排二免，時間大致是初免一個月到半年內，J場對于種兔還在第二年再兔一次。從免疫效果上看，三種疫苗均是組織滅活苗，六個兔場(生產基地)將疫苗購回后均能進行低溫保存和按規(guī)定使用，根據(jù)兩年來的檢測結果我們認為疫苗質量、免疫情況較好，沒有發(fā)生疫情。

另外，根據(jù)我們的調查，浙江省健康的實驗兔中RHDV(14只陽性)仍然存在，其中3個PCR檢測結果為陽性的樣本與用HAI法檢測結果不一致(該法檢測結果為陰性)，原因可能與RHDV的表達產物是否有活性有關。因此，今后對于該病的防控，兔場最好應定期對兔病毒性出血癥 HAI抗體滴度進行監(jiān)測，滴度在24以下時即進行免疫。同時，免疫前應對疫苗效價進行監(jiān)測，血凝價低于24時，應停止使用該批疫苗。我們主張每個場繼續(xù)保持現(xiàn)有的免疫方式和疫苗來源，以鞏固目前的防御效果為目標，但因調查時發(fā)現(xiàn)健康兔群中RHDV依然存在，因此對該病就應該給予足夠的重視，按時免疫和加強飼養(yǎng)管理，防止因為疫苗保存或管理不善造成免疫失敗從而招致疫情爆發(fā)。

［1］ Sánchez－Campos S，Alvarez M，Culebras JM，et al.Pathogenic molecular mechanisms in an animal model of fulminant hepatic failure:Rabbit hemorrhagic viral disease［J］.The J Lab Clin Med，2004，144(4):215－222.

［2］ 劉月環(huán)，樓琦，金曉音，等.兔出血癥病毒遺傳變異分析及RT－PCR檢測方法的建立［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2008，18 (11):44－49.

［3］ Rodak L et al.Enzyme－linked immunosorbent assay of antibodies to rabbit hemorrhagic disease virus and determination of its major structural proteins.J Gen Virol，1990，71:1075－1080.

［4］ 佟承剛.家兔出血癥疫苗免疫失敗原因及對策［J］.中國養(yǎng)兔雜志，1996，6:30－31.

Establishment of Three Methods for Detection of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus in Rabbits and Investigation of Their Immunization Effects

ZHOU Wen－wei，LIU Yue－h(huán)uan
(Zhejiang Provincial Center of Laboratoy Animals，Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013，China)

ObjectiveTo investigate the rabbit hemorrhagic disease virus(RHDV)prevalence in six rabbits farms in Zhejiang province，and evaluate the immunization effects of Zhejiang RHDV rabbit vaccines。Methods1168 serum samples of laboratory rabbits were tested for the RHDV by hemagglutination inhibition(HAI)and ELISA assays. RT－PCR was employed to detect the RHDV prevalence。ResultsImmunization of rabbits in our province was good，although the passing rate was varying，there was no epidemic outbreak.By the two indirect serum detection methods，HAI and ELISA，the passing rate of ELISA method was significantly higher than that of the HAI method。Conclusions Three detection methods have been established，suitable for the detection and control of RHDV in laboratory rabbits in Zhejiang province.It provides an effective means of detection，prevention and control of rabbit hemorrhagic disease outbreak.

Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV;Hemagglutination inhibition，HAI;Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA;Reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR

R－33

A

1671－7856(2010)04－0059－04

2009－12－15

浙江省科技廳實驗動物科技計劃項目(2007F80011)。

周文偉(1969－)，女，實驗師，研究方向:動物醫(yī)學，E－mail:hh5498@126.com。

劉月環(huán)(1974－)，女，副研究員，碩士，研究方向:生物技術與實驗動物育種，E－mail:yuehuanliu@163.com。