張 偉,馮 娟,陳 煒,張小娟,袁樹民,廉 虹,張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

研究報告

系統(tǒng)表達(dá) HB-EGF轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

張 偉,馮 娟,陳 煒,張小娟,袁樹民,廉 虹,張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

目的建立系統(tǒng)表達(dá)肝素結(jié)合性表皮生長因子 (HB-EGF)的轉(zhuǎn)基因動物模型,利用轉(zhuǎn)基因動物模型研究 HB-EGF與組織纖維化的關(guān)系。方法RT-PCR法克隆小鼠 HB-EGF基因,將其插入 Chickenβ-actin啟動子下游,構(gòu)建 Chickenβ-actin-HB-EGF表達(dá)載體,利用顯微注射的技術(shù)把表達(dá)載體注射到受精卵的雄原核中,建立 HBEGF轉(zhuǎn)基因小鼠。利用特異引物 PCR的方法鑒定轉(zhuǎn)基因的基因型,采用Western Blot方法鑒定 HB-EGF基因在全身組織的表達(dá)。分別取 HB-EGF轉(zhuǎn)基因鼠與同窩陰性小鼠的肝、腎、肺及膀胱組織進(jìn)行Massion染色。結(jié)果建立了系統(tǒng)表達(dá) HB-EGF轉(zhuǎn)基因小鼠,Western Blot發(fā)現(xiàn)其 HB-EGF在肝、肺、腎及膀胱的表達(dá)與同窩陰性對照小鼠相比明顯增加。Massion染色結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因鼠肝、肺、腎及膀胱組織纖維化程度明顯高于同窩陰性對照小鼠。結(jié)論成功建立了系統(tǒng)表達(dá) HB-EGF轉(zhuǎn)基因小鼠,HB-EGF的過度表可顯著加重組織纖維化程度。

肝素結(jié)合性表皮生長因子;轉(zhuǎn)基因;小鼠;纖維化

1991年,Higashiyama等[1]首先在巨噬細(xì)胞樣 細(xì)胞 U-937中發(fā)現(xiàn)了肝素結(jié)合性表皮生長因子(HB-EGF)。HB-EGF屬表皮生長因子 (EGF)家族成員之一,在全身不同的組織中均有表達(dá),主要存在于肺、心臟、腦以及骨骼肌中。它參與許多生理過程,如傷口愈合、眼瞼形成、胚泡的植入、腎收集管的形態(tài)建成以及癌變過程等[2-4]。HB-EGF具有強大的促有絲分裂、趨化因子、黏附分子等生物活性。2003年, Iwamoto等[5]建立了 HB-EGF基因敲除小鼠,小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的心衰,并且伴有心室和心瓣膜擴張,影響了心肌正常的功能,這說明 HB-EGF對于心臟正常發(fā)育是十分重要的。HB-EGF活性異常會導(dǎo)致許多心血管病理過程,如心肌肥厚、平滑肌細(xì)胞增生以及肺性高血壓[6-8]。器官纖維化 (organ fibrosis)一直是研究醫(yī)學(xué)的熱點問題之一,最近幾年的研究表明,HB-EGF與多種組織器官纖維化過程密切相關(guān)。纖維化 (fibrosis)引起器官內(nèi)纖維結(jié)締組織增多,實質(zhì)細(xì)胞減少,持續(xù)進(jìn)展可導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退,乃至器官衰竭,嚴(yán)重影響人類健康。纖維化是多種慢性病的病理和組織學(xué)基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步的研究 HB-EGF在纖維化過程中的作用,我們建立了系統(tǒng)表達(dá) HB-EGF基因轉(zhuǎn)基因小鼠模型,旨在研究 HB-EGF與慢性肝病、慢性腎病等慢性疾病所引起的組織病理性纖維化的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及儀器

pCAGGS-AD質(zhì)粒為本實驗室保存。Trizol提取液、SuperScript.First-Strand Synthesis System for RTPCR購自 Invitrogen公司。T4 DNA ligase購自 NEB公司。Q IAquick Gel Extraction Kit購自 Q IAGEN公司。引物合成及測序由上海英俊公司完成。HBEGF(M-18)多克隆抗體、Western blotting luminal reagent為 Santa Cruz公司產(chǎn)品。Prestained protein marker,broad range購自 Fer mentas。辣根酶標(biāo)記兔抗山羊 IgG購自中杉金橋。3～4周齡Balb/c雌性小鼠購自維通利華。顯微注射儀為 Nikon TE2000.U,倒置顯微鏡為Olympus產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 獲得目的基因:Trizol法提取 C57BL/6小鼠肺臟的總 RNA,用 SuperScript.First.Strand Synthesis System for RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得肺臟總cDNA,通過高保真酶進(jìn)行 PCR擴增獲得帶有 HindⅢ酶切位點的 HB-EGF cDNA,上游引物為:5′-CCAAGCTTATCCAAAGTGATCGCTGC CTC-3′;下游引物為:5′-CCAAGCTTAAGTAGCCTCTGAAGGTT CCTATAG-3′。目的條帶為 709 bp。將其與 pMD18-TVector連接送去測序,發(fā)現(xiàn)無突變,以 HindⅢ酶切回收該片斷。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因注射片段的制備:用于轉(zhuǎn)基因的載體pCAGGS-AD含有全身組織表達(dá)的啟動子 chickenβactin。將載體 pCAGGS-AD用 HindⅢ酶切,去磷酸化,膠回收載體。用 T4 DNA ligase將酶切后的載體和經(jīng)測序正確的目的片段連接,構(gòu)建成 pCAGGSAD-HB-EGF表達(dá)載體。然后經(jīng) PvuI酶切將表達(dá)載體線性化,Sephedex-G50柱純化 DNA,通過凝膠電泳進(jìn)行定量后用于顯微注射。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因操作:用孕馬血清和人絨毛膜促性腺激素對 3、4周齡的 C57BL/6小鼠進(jìn)行超排后,從輸卵管的壺腹部將受精卵取出,向受精卵雄原核中注入DNA溶液,在二氧化碳孵箱 (37℃)中培養(yǎng)過夜,將發(fā)育成兩細(xì)胞的卵挑選出來,移植到 ICR假孕小鼠的輸卵管中。

1.2.4 PCR法鑒定 HB-EGF轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型:本實驗通過設(shè)計跨外顯子的特異引物,采用 PCR擴增技術(shù),確認(rèn)小鼠中是否有轉(zhuǎn)入的基因。轉(zhuǎn)基因小鼠在出生 9～14 d用剪趾法標(biāo)記,收集剪下的組織,用高鹽法提取基因組DNA,利用特異引物進(jìn)行 PCR檢測。在 20μL體系中加入:10 ×PCR Buffer 2 μL,25 mmol/L MgCl 1μL,10 mmol/L dNTP 0.4 μL,上游引物 (50μmol/L)0.2μL,下游引物 (50 μmol/L)0.2μL,模板 DNA 1μL,Taq DNA polymerase(5 U/μL)1μL,ddH2O 15μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變 4 min,循環(huán)參數(shù)為 94℃30 s,60℃30 s,72℃30 s,30個循環(huán)后 72℃延伸 7 min。上游引物為5′-GTCGGTGATGCTGAAGCTC-3′;下游引物為5′-CTACAGCCACCACAGCCAAG-3′,目的條帶為491 bp。

1.2.5 Western Blot:分別提取兩個首建鼠的 Fl代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對照小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、胰臟、小腸、骨骼肌、膀胱、睪丸、子宮組織的蛋白,進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC膜上,置于 5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉 1 h;加入1∶200稀釋的 HB-EGF(M.18)多克隆抗體,用雜交袋封住,4℃孵育過夜。倒掉一抗,用TBST洗膜 3次,每次 10 min。然后加入1∶10 000辣根過氧化酶標(biāo)記兔抗山羊的二抗,置于搖床上搖動,室溫下 1 h。棄去二抗,TBST洗膜 3次,每次 5 min,TBS洗膜 1次,10 min。將膜置于化學(xué)發(fā)光劑中,曝光、顯影及定影,用 SynGene GeneTools軟件分析所得的結(jié)果。

1.2.6 Masson染色:分別取 HB-EGF轉(zhuǎn)基因鼠與同窩陰性小鼠的肝、腎、肺及膀胱組織,固定于 4%中性甲醛中,做石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水。Masson復(fù)合染色 5 min,0.2%醋酸水溶液稍洗,5%磷鎢酸5～10 min,0.2%醋酸水溶液浸洗 2次,脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察,膠原纖維為綠色。

2 結(jié)果

2.1 獲得轉(zhuǎn)基因注射片斷

得到的目的片斷與 T載體連接后送去測序,測序結(jié)果經(jīng) Blast分析顯示,709 bp的 HB-EGF cDNA與 Genebank中序列的同源性為 100%。由于線形DNA的整合效率高于環(huán)形的 DNA,將構(gòu)建的環(huán)形pCAGGS-AD-HB-EGF表達(dá)載體用 PvuI酶切后,得到了線形的DNA片斷(圖 1),濃度為 3 ng/μL用于顯微注射。

圖 1 轉(zhuǎn)基因注射片斷的構(gòu)建Fig.1 The construction of transgenic fragment

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型的鑒定

用特異引物對 HB-EGF轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組進(jìn)行 PCR擴增,結(jié)果的到兩只陽性首建鼠(圖 2)。

圖 2 HB-EGF轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型分析Fig.2 Genotyping HB-EGF transgenic mice with PCR

2.3 HB-EGF基因的表達(dá)

用Western Blot方法檢測 HB-EGF蛋白在心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、胰臟、小腸、骨骼肌、膀胱、睪丸、卵巢、子宮組織的表達(dá)情況,結(jié)果表明,HB-EGF在心、肝、肺、腎、胃、胰臟、骨骼肌、膀胱、睪丸、卵巢、子宮組織均有表達(dá);兩只首建鼠的 F1代陽性轉(zhuǎn)基因鼠的肝、腎、肺及膀胱組織中 HB-EGF蛋白的表達(dá)明顯高于同窩陰性對照小鼠 (圖 3)。

圖 3 Western Blotting鑒定 HB-EGF蛋白在轉(zhuǎn)基因鼠肝、腎、肺和膀胱組織的表達(dá)Fig.3 Western blotting analysis of HB-EGF expression in liver,kidney,lung,and bladder

2.4 Masson染色

光鏡下觀察,膠原纖維為綠色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)基因鼠 F1代肝、腎、肺和膀胱組織細(xì)胞間的膠原纖維明顯多于同窩陰性對照小鼠(圖 4見彩插 5)。

3 討論

近年大量研究結(jié)果表明,細(xì)胞因子通過作用于細(xì)胞表面的相應(yīng)受體,在促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluarmatrix,ECM)積聚和器官纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用。參與器官纖維化常見的細(xì)胞因子有轉(zhuǎn)化生長因子-β(transfor ming growth factor-β, TGF-β)、血小板源生長因子 (platelet-derived growthfactor,PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生長因子(epider mal growth factor, EGF)、白 介 素-1 (interleukin-1, IL-1)、 IL-6、 IL-8、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、γ-干擾素 (interfer -γ, INF-γ)和胰島素樣生長因子 (insulin-like growth factor,IGF-1)等。在生理情況下,眾多細(xì)胞因子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)處于平衡狀態(tài),但在病理情況下,這一平衡被打破,正向調(diào)節(jié)纖維化的細(xì)胞因子增加,并發(fā)生級聯(lián)反應(yīng),而負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子減少,從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積而形成纖維化。

越來越多的證據(jù)證明,在多種組織和器官的纖維化過程中,HB-EGF發(fā)揮著非常重要的作用。Means等[9]對胰腺特異表達(dá)的 HB-EGF轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明,HB-EGF轉(zhuǎn)基因小鼠胰島間質(zhì)增多,隨著年齡的增長胰腺內(nèi)分泌室和外分泌室均發(fā)生纖維化,并進(jìn)一步誘發(fā)高血糖和胰臟導(dǎo)管上皮細(xì)胞增生,提示 HB-EGF引起胰島和間質(zhì)的相互作用導(dǎo)致胰腺疾病的發(fā)生。鑒于成纖維細(xì)胞和胰島的黏附需要生長因子受體 (EGFR)活性,這一信號通路可能參與胰腺疾病的纖維化部分。Ingram等[10]研究表明, HB-EGF與腎成纖維細(xì)胞增生有關(guān),在釩誘導(dǎo)的腎成纖維細(xì)胞增生中 HB-EGF表達(dá)明顯增加,且MAPK(ERK)信號通路參與這一過程。以往研究表明,在部分肝臟切除后的新生肝中,HB-EGF只在非實質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),而不在肝細(xì)胞中表達(dá)。但 Kiso等[11]研究發(fā)現(xiàn),在肝癌形成過程中,HB-EGF會在纖維變性的肝細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)。Ushikoshi等[12]利用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)心肌梗死 (M I)的兔子,除發(fā)現(xiàn)能夠?qū)е伦笮氖曳屎裢?還加速了細(xì)胞程序化凋亡和纖維化的水平,在M I部位出現(xiàn)成肌纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞積聚。體外實驗顯示 HB-EGF主要表達(dá)于培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞。表明 HB-EGF可能對心臟成纖維細(xì)胞的生長發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,提示 HB-EGF很可能成為治療心肌肥厚和纖維化的治療靶點。

對本實驗所構(gòu)建的系統(tǒng)表達(dá) HB-EGF轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明,隨著肝、腎、肺和膀胱組織的 HB-EGF表達(dá)升高,其纖維化程度加重,提示 HB-EGF在這些組織纖維化的過程中發(fā)揮著重要作用,而其具體分子機制有待進(jìn)一步研究。

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The Establishment of HB-EGF System ic Expression in Transgen icM ice

ZHANGWei,FENG Juan,CHEN Wei,ZHANG Xiao-juan,YUAN Shu-min,L IAN Hong,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Diseases ComparativeMedicine,Ministry of Health;Institute ofLaboratory Animal Science,Chinese Academy ofMedical Sciences(CAMS)&Comparative Medicine Centre,PekingUnionMedical Collage(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo construct heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor(HB-EGF) transgenic mice in order to investigate the role of HB-EGF in the fibrosis of tissues.M ethod HB-EGF gene was cloned for m mouse with RT-PCR.The cloned HB-EGF gene was then inserted downstream of Chickenβ-actin promoter to construct the vector which could express HB-EGF gene in system.The transgenic mice were produced by microinjection method and the genotype was detected by PCR with specific primers.The expression profiles of HB-EGF in body tissues were illustrated by Western Blot.Massion staining of liver,lung,kidney and bladder from transgenic mice and nontransgenic control mice was carried out。ResultsTwo lines of HB-EGF transgenic mice were established.The expression levels of the HB-EGF gene in liver,lung,kidney and bladder from transgenic mice were obviously higher than those form controlmice.The extents of fibrosis in the liver,lung,kidney and bladder of transgenic mice were significantly enhanced by the expression of the transgene。ConclusionTwo lines of system-expressing HB-EGF transgenic mice were established successfully.The over-expression of HB-EGF can significantly aggravate tissues fibrosis degree.

Heparin-binding epidermal growth factor;Transgene;Mouse;Fibrosis

R349.83

A

1671-7856(2010)01-0032-04

2009-09-11

衛(wèi)生部行業(yè)基金,實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501-026)。

張偉(1980-),男,博士,主要研究方向:心肌病病理機制。

張連峰。E-mail:zhanglf@cnilas.org