全雄志,董 偉,曹興水,張連峰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

研究報(bào)告

24-脫氫膽固醇還原酶基因轉(zhuǎn)基因小鼠血生化指標(biāo)分析

全雄志,董 偉,曹興水,張連峰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

目的建立全身表達(dá) 24-脫氫膽固醇還原酶基因(Dhcr24)轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型,研究該基因過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠代謝的影響。方法RT-PCR法克隆小鼠Dhcr24基因,把該基因插入 CMV啟動(dòng)子下游,構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,通過(guò)顯微注射法建立Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR鑒定Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型,RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)基因表達(dá)水平,血生化檢測(cè)儀檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠血生化指標(biāo)的改變。結(jié)果建立了2個(gè)不同表達(dá)水平的Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠品系,轉(zhuǎn)入的 Dhcr24基因在肝和脾組織中的表達(dá)高于內(nèi)源的 Dhcr24。血生化檢測(cè)證實(shí):乳酸脫氫酶(LDH)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)和血肌酐(SCr)較野生型小鼠明顯降低,而高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-c)和堿性磷酸酶(ALP)較野生型小鼠明顯增加,并且 Dhcr24轉(zhuǎn)基因雌鼠的體重比野生型小鼠明顯降低,均有顯著差異。但Dhcr24轉(zhuǎn)基因雄鼠各項(xiàng)指標(biāo)與野生型小鼠相比沒(méi)有顯著差異。結(jié)論成功建立了全身表達(dá) Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠,并證實(shí)Dhcr24基因?qū)Υ菩孕∈蟮捏w重和血生化指標(biāo),包括 LDH,TP,Alb,SCr,HDL-c and ALP具有明顯的影響。

24-脫氫膽固醇還原酶;轉(zhuǎn)基因小鼠;血生化指標(biāo)

膽固醇是動(dòng)物體內(nèi)必不可少的一種生物分子,是類(lèi)固醇激素和膽汁酸的前體,也是制造副腎皮質(zhì)激素和性激素的材料。除了是細(xì)胞膜、脂質(zhì)筏和細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷的主要組成部分外,還參與蛋白質(zhì)修飾過(guò)程[1-3]。但是,如果體內(nèi)膽固醇過(guò)多,就會(huì)造成動(dòng)脈硬化、狹心癥、心肌梗死、中風(fēng)、糖尿病和中樞性眩暈等疾病。24-脫氫膽固醇還原酶基因 (24-Dehydrocholesterol reductase,Dhcr24)編碼的蛋白為516個(gè)氨基酸組成的多肽,催化 24-脫氫膽固醇的δ-24位雙鍵的加氫反應(yīng),產(chǎn)生的膽固醇,是膽固醇合成的最后一步。Dhcr24的活性依賴黃素腺嘌呤二核苷酸的存在[4]。Dhcr24在腎上腺、腦的延髓、腦橋、前列腺,肝臟、心臟、卵巢和腸等組織中均有表達(dá)[5,6]。本文通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù),將 Dhcr24基因轉(zhuǎn)入 C57BL/6J小鼠,建立全身表達(dá) Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠,并分析了Dhcr24基因?qū)ρ推渌荷笜?biāo)的影響。

1 材料和方法

1.1 Dhcr24表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

Trizol法提取小鼠心臟總 RNA(Invitrogen公司),用逆轉(zhuǎn) PCR擴(kuò)增 C57BL/6J小鼠全長(zhǎng)的Dhcr24 cDNA,把擴(kuò)增片段插入 pMD-18T載體,進(jìn)行測(cè)序(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司,中國(guó))。以Hind III和 Xho I進(jìn)行酶切回收該片段,基因克隆入CMV啟動(dòng)子下游,構(gòu)建 Dhcr24轉(zhuǎn)基因載體。轉(zhuǎn)基因載體用 Not I線性化 (寶生物工程有限公司,中國(guó)),調(diào)整濃度至 5 ng/μL,用顯微注射法將線性化的基因載體注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中[小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,康藍(lán)公司XCXK(京)2004-001],用 I CR小鼠作假孕受體[I CR小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,XCXK(京)2007-0001],制備轉(zhuǎn)基因小鼠(TE2000-U顯微注射儀)[7]。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物福利和管理委員會(huì)的批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào)為 GC-07-2010。

1.2 PCR鑒定Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生 9～14 d用剪趾法標(biāo)記,收集剪下的組織,用堿解法提取基因組 DNA[8],用PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因表型檢測(cè),PCR引物為5′-GGGACATCCAGAAACAGGTCC-3′和 5′-GACGGT GTGCAGCGCACAAAG-3′(上海生物工程技術(shù)有限公司,中國(guó))。PCR反應(yīng)體系為 20μL(試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司,中國(guó)),反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 3 min,94℃變性 30 s,54℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,重復(fù)變性至延伸 29次,完成 30個(gè)循環(huán)。目的基因Dhcr24片斷為 390 bp。

1.3 RT-PCR和W estern Blot檢測(cè)鑒定 Dhcr24基因的表達(dá)

Trizol法提取 4只 Dhcr24轉(zhuǎn)基因 F1代 3月齡和同月齡野生小鼠的脾臟總 RNA。RT-PCR擴(kuò)增目的基因片段的引物為上游 5′-GGGACATCCAG AAACAGGTCC-3′和下游 5′-GGGCTCCACTCGA ACAATCTGT-3′,目 的 片 段 大 小 為 196 bp, Glyceraldegyde-3-phosphate(GAPDH)內(nèi)參上游引物為 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′,下游引物為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,擴(kuò)增片段大小為 451 bp。分別提取 4只Dhcr24轉(zhuǎn)基因 F1代 3月齡和同月齡野生小鼠的脾臟總蛋白,進(jìn)行 SDSPAGE凝膠電泳,將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到 NC膜上 (購(gòu)自Millipose公司),置于 5%脫脂奶粉封閉液中,室溫下 1 h。加入1∶100羊抗 Dhcr24單克隆抗體 (購(gòu)自Santa Cruz,美國(guó)),室溫 1 h后,置于 4℃過(guò)夜。將膜取出,用 TBST洗膜 3次,每次 10 min。加入 1: 10000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗羊二抗 (購(gòu)自Pierce,美國(guó))和1∶10000抗 GAPDH抗體作為內(nèi)對(duì)照(購(gòu)自康成生物,中國(guó)),室溫?fù)u床搖動(dòng) 1 h。取出膜,用 TBST洗膜 2次,TBS洗膜 1次,每次 10 min。將膜置于化學(xué)發(fā)光液中 (購(gòu)自 Santa Cruz,美國(guó)),曝光、顯影及定影。

1.4 血生化檢測(cè)Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠

選用 1月齡的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性和野生型雄性小鼠各6只以及雌性小鼠各 6只,禁食 12 h后,記錄各自的體重,眼眶靜脈采血,室溫靜置 2 h后,3000 r/min, 4℃離心 15 min分離血清,根據(jù)臨床檢驗(yàn)程序檢查血生化指標(biāo)(日立 7020,日本)。

2 結(jié)果

2.1 Dhcr24表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型的鑒定

用 RT-PCR克隆小鼠 Dhcr24 cDNA,測(cè)序結(jié)果表明克隆的 cDNA同已報(bào)道的 Dhcr24序列完全一致(GenBank No.NM_053272)。將該基因插入全身特異表達(dá)的 CMV的下游,構(gòu)建 Dhcr24轉(zhuǎn)基因載體(圖 1)。

圖 1 Dhcr24轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體Fig.1 Dhcr24 transgenic construct

用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,轉(zhuǎn)入到假孕受體 ICR小鼠中,小鼠出生后9～14 d提取基因組DNA,用 PCR擴(kuò)增Dhcr24目的基因 390bp的片段來(lái)鑒定 Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠 (圖 2),共得到 4只首建鼠,均可傳代,留下兩個(gè)表達(dá)水平較高的保種,并進(jìn)行表型分析。

圖 2 PCR鑒定Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠的凝膠電泳分析Fig.2 Deter mination of the transgenic mouse with PCR

2.2 Dhcr24基因的表達(dá)

RT-PCR擴(kuò)增心臟 Dhcr24。產(chǎn)物長(zhǎng)度為 196 bp。GAPDH內(nèi)參的長(zhǎng)度為 451 bp,結(jié)合 Western blotting,結(jié)果顯示:首建鼠 2和 3的 Fl代 3月齡小鼠Dhcr24基因表達(dá)水平明顯要高于野生型 (圖 3, 4)。

2.3 Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠的體重和血生化指標(biāo)檢查結(jié)果

圖 3 RT-PCR鑒定Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)Fig.3 Deter mination of the transgenic mouse with RTPCR

圖 4 Western Blot分析Dhcr24基因在脾中的表達(dá)Fig.4 Deter mination ofthe transgenicmice gene expression withWestern Blot

圖 5 3月齡DHCR24轉(zhuǎn)基因雌鼠和同月齡野生型小鼠體重比較Fig.5 Comparison of the body weight be tween the female wild type and the transgenic mice at the age of three month

1月齡 Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡野生型小鼠進(jìn)行體重 (圖 5)和血生化指標(biāo)分析 (表 1),結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因雌鼠的體重比同齡野生小鼠減輕了18.5%(P<0.01)。血生化指標(biāo)檢測(cè)分析證實(shí),轉(zhuǎn)基因雌性小鼠與野生小鼠相比,血液 TP降低了11.9%(P<0.01),Alb降低了 13.3%(P<0.05), LDH降低了 41.0%(P<0.01),SCr降低了 20.0%(P<0.01)。而一齡轉(zhuǎn)基因雌性小鼠比野生小鼠相比,血液 HDL-c增加了 33.3%(P<0.01),ALP增加 105.2%(P<0.01)。

表 1 雌性野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠血生化指標(biāo)的比較Tab.1 Comparison of the blood chemistry between the female wild type and the transgenic mice at the age of three month

3 討論

本研究經(jīng)過(guò) RT-PCR和Western Blot篩選,得到2個(gè)高表達(dá) Dhcr24基因的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。在一月齡,轉(zhuǎn)基因雌鼠比同齡野生小鼠的 LDH、TP、Alb和 SCr分別降低 41.0%、18.5%、13.3%和 20.0%,而 HKL-c和 ALP則各增加了 33.3%和 105.2%。除了Alb具有顯著差異 (P<0.05)外,其它指標(biāo)均為高度顯著差異 (P<0.01)。同時(shí),轉(zhuǎn)基因雌鼠的體重比同齡野生小鼠減輕了 18.5%(P<0.01)。

乳酸脫氫酶 (1actate dehydrogenase,LDH)是人體糖酵解途徑中一種重要代謝酶,能催化乳酸脫氫生成丙酮酸,主要分布于腎臟、心肌、肝臟、紅細(xì)胞和白細(xì)胞等組織細(xì)胞的胞質(zhì)中,其中以腎臟含量較高[9]。有研究表明,雌激素可參與調(diào)節(jié)心肌組織CK、LDH及AST的生成[10],大鼠摘除卵巢兩周后,血中濃度顯著降低,心肌組織 CK、LDH及AST活性也明顯降低[11]。本實(shí)驗(yàn)顯示,DHCR24轉(zhuǎn)基因雌鼠和同齡野生小鼠相比,LDH明顯降低,而雄性組卻沒(méi)有變化。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因雌鼠血乳酸水平升高可能與機(jī)體抗疲勞能力、機(jī)體肝糖原和肌糖原的貯備以及腎臟、骨骼肌、肝臟及心肌耐缺氧能力減弱有著一定的聯(lián)系,也可能是DHCR24轉(zhuǎn)基因雌鼠的雌激素分泌受到的一定的抑制。

血清蛋白質(zhì) (total protein,TP)是各種蛋白的復(fù)雜混合物,是人體內(nèi)重要的運(yùn)輸載體,是維持滲透壓的重要成分,也是了解營(yíng)養(yǎng)狀況以及機(jī)體蛋向質(zhì)代謝狀況的一個(gè)重要指標(biāo)。對(duì)血漿蛋白各組分含量的測(cè)定有助于提供有價(jià)值的生理信息[12]。而白蛋白(albumin,Alb)是由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成,是血漿中含量最多的蛋白質(zhì),占血漿總蛋白的 40%～60%,其合成率雖然受食物中蛋白質(zhì)含量的影響,但主要受血漿中白蛋白水平調(diào)節(jié)。當(dāng)肝臟發(fā)生病變時(shí),肝細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能減退,血漿中蛋白質(zhì)即會(huì)發(fā)生質(zhì)和量的變化,白蛋白也隨之降低,如肝硬變合并腹水及其他肝功能?chē)?yán)重?fù)p害、營(yíng)養(yǎng)不良、慢性消化疾病和腎病綜合征等。血清總蛋白 (TP)、白蛋白 (Alb)的測(cè)定可作為評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)及消化功能的指標(biāo),了解體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的狀況,其含量的變化還與外界環(huán)境有關(guān)[13]。有研究表明,在低氧的條件下,大鼠血漿中的 TP和Alb明顯降低[14]。DHCR24轉(zhuǎn)基因雌鼠機(jī)體合成蛋白能力受阻,可能導(dǎo)致肝臟、腎臟的病變和機(jī)體耐缺氧能力減弱。并且,由于體內(nèi)蛋白質(zhì)減少,造成營(yíng)養(yǎng)不良,這可能是直接影響到Dhcr24轉(zhuǎn)基因雌鼠體重下降的主要因素。這需要對(duì)轉(zhuǎn)基因雌鼠做進(jìn)一步的代謝和氧耗實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)明這一點(diǎn)。

肌酐 (creatinine,Cre)是肌肉在人體內(nèi)代謝的產(chǎn)物,肌酐主要由腎小球?yàn)V過(guò)排出體外。血中肌酐來(lái)自外源性和內(nèi)源性兩種,外源性肌酐是食物在體內(nèi)代謝后的產(chǎn)物;內(nèi)源性肌酐是體內(nèi)肌肉組織代謝的產(chǎn)物[15]。而 Dhcr24轉(zhuǎn)基因雌鼠血肌酐的降低說(shuō)明Dhcr24基因可能影響了小鼠攝食量或者腎臟腎小球?yàn)V過(guò)功能受損,這需要作進(jìn)一步的研究分析。

堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)是一種磷酸單酯酶,廣泛存在于人體組織和體液中,血清ALP主要來(lái)自肝膽系統(tǒng)、骨骼及腸道。膽道系統(tǒng)是ALP產(chǎn)生的主要部位[16],ALP測(cè)定主要用于肝病和骨病的臨床診斷,當(dāng)肝內(nèi)和肝外膽汁排泄受阻時(shí),肝組織表達(dá)的 ALP不能排出體外而回流入血導(dǎo)致ALP的升高。ALP在肝臟中主要分布于肝細(xì)胞的血竇內(nèi)側(cè)和毛細(xì)膽管側(cè)的微絨毛上,經(jīng)膽汁排入小腸,當(dāng)毛細(xì)膽管內(nèi)壓升高,可誘發(fā) ALP產(chǎn)生增多[17]。

高密度脂蛋白主要是由肝臟合成,它是由載脂蛋白、磷脂、膽固醇和少量脂肪酸組成。高密度脂蛋白膽固醇 (high-density lipoprotein cholesterol,HDL-c)的功能特性是助長(zhǎng)膽固醇從動(dòng)脈壁向肝臟運(yùn)送,并經(jīng)肝轉(zhuǎn)化代謝。因此,HDL-c能將膽固醇從肝外組織轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟進(jìn)行代謝,并以膽汁形式排出體外,并具有限制LDL-c微粒的氧化作用,從而減慢血管內(nèi)斑塊的形成。但是,當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)感染、炎癥時(shí), HDL-c在調(diào)整全身炎癥的過(guò)程中,以上功能發(fā)生改變,成為“功能不全”的“炎癥前高密度膽固醇”的狀態(tài),它有助于血管粥樣斑塊的氧化和炎變[17]。表達(dá)Dhcr24轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠的左心室壁變厚,心室腔變小,每分鐘心輸出量和射血分?jǐn)?shù)都比野生型同齡小鼠有明顯提高[18],這可能與 HDL-c的增加有著必然的聯(lián)系。

綜上所述,我們已經(jīng)成功建立了全身表達(dá)的Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并證實(shí) Dhcr24基因?qū)Υ菩孕∈蟮捏w重和血生化指標(biāo),包括 LDH,TP,Alb, SCr,HDL-c和ALP具有明顯的影響,而 Dhcr24轉(zhuǎn)基因雄鼠在體重和血生化指標(biāo)上沒(méi)有明顯的變化。這種 Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠的性別差異性與報(bào)道DHCR24轉(zhuǎn)基因小鼠的性別特異性自主活動(dòng)和應(yīng)激反應(yīng)[19]結(jié)論一致。這為進(jìn)一步研究該基因在心血管疾病的作用機(jī)制提供了重要的動(dòng)物模型。

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The Effect of Dhcr24 on Blood Chem istry in the Dhcr24 Transgen ic M ouse

QUAN Xiong-zhi,DONGWei,CAO Xing-shui,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Diseases ComparativeMedicine,Ministry of Health;Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Sciences(CAMS)&ComparativeMedicine Centre,PekingUnionMedical Collage(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo establish the transgenic mouse of 24-dehydrocholesterol reductase gene(Dhcr24)to study the effect ofDhcr24 on metabolis m in vivo.M ethod The mouse Dhcr24 was clone by RT-PCR and the sequence of the cDNA was confirmed by sequence analysis.The transgenic plasmidwas constructed by inserting the Dhcr24 gene in the downstream of CMV promoter.The transgenic mice were generated bymicroinjection method and the genotype was detected by PCR.The expression levels of the gene were deter mined with RT-PCR andWestern Blot.The blood biochemistry items were detected with a Photometer Reflotron Plus for blood following clinical procedure.Result Two transgenic C57BL/6J lines of Dhcr24 gene with different expression levels were established.The expression of the Dhcr24 gene was obviously detected in the liver and spleen.The transgenic mice showed obviously decreased levels of weight,lactic dehydrogenase (LDH),total protein(TP),Albumin(Alb)and serum creatinine(SCr)comparedwith thatof thewild type mice,whilethe increased high-density lipoprotein cholesterol and increased alkaline phosphatase(ALP)were detected in the transgenic mice。ConclusionThe DHCR24 transgenic mice were established successfully and indicated the Dhcr24 gene regulated bodyweight of the female mice and the blood chemistry included the levels of LDH,TP,Alb,SCr,HDL-c and ALP of female mice.

Dhcr24;Transgenic mouse;Blood chemistry

R541

A

1671-7856(2010)01-0036-05

2009-09-08

衛(wèi)生部項(xiàng)目,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類(lèi)疾病動(dòng)物模型資源擴(kuò)展(200802036)和十一五新藥專(zhuān)項(xiàng)支持(2009ZX09501-026)。

全雄志,研究實(shí)習(xí)員。

張連峰。E-mail:zhanglf@mail.cnilas.org