蘭 欣

(青島職業(yè)技術學院生物化工學院,山東青島266555)

氰戊菊酯對牙鲆鰓細胞系體外的細胞毒性＊

蘭 欣

(青島職業(yè)技術學院生物化工學院,山東青島266555)

采用牙鲆鰓細胞系FG-9307,測定擬除蟲菊酯類農(nóng)藥氰戊菊酯的體外細胞毒性.細胞生長速度在測試質量濃度5,10和15μg/mL顯著降低.此外,三種應用比較廣泛的測試終點方法——中性紅吸收實驗法、四唑鹽比色實驗法、細胞蛋白分析法被用于檢測氰戊菊酯的體外細胞毒性.實驗證明三種測試方法的細胞毒性的相關性很高,并不因測試終點不同而不同.這說明FG細胞系有可能成為檢測氰戊菊酯體外細胞毒性的合適的生物指標.

氰戊菊酯;牙鲆鰓細胞系;體外細胞

水環(huán)境中的污染物對海洋生物甚至整個生態(tài)系統(tǒng)都是潛在的威脅.魚類急性試驗是評估化學制品的水生生物毒性的常規(guī)方法.以前,大量的水體中化學制品的急性毒性數(shù)據(jù)來自成體魚的LC50實驗,即測定化學藥品作用一段特定的時間(通常指96h)的半致死濃度.然而,這種體內(nèi)實驗成本高、費時,且需要特殊的實驗設備.因此,需要建立快速有效的生物檢測方法來檢測化學制品的潛在毒性.Rachlin和Perlmutter(1968)首次提出將培養(yǎng)的魚類細胞系用于水體污染物的急性體外細胞毒性分析.Kocan等(1979),Marion和Denizeau(1983),Bols等(1985),Babich等(1986),Babich和Borenfreund (1987)[1,2],以及Saito等(1991)[3]運用多種主要來源于淡水魚類的細胞系將體外細胞毒性分析法進一步推廣.最近,源于Poeciliopsis lucidas的魚類肝細胞瘤的細胞系PLHC-1被Huuskonen等(1998)用于評價纖維素和木片提取物的急性細胞毒性.源于海水魚Paralichthys olivaceus的牙鲆鰓細胞系FG-9307被用于測定有機磷農(nóng)藥的體外細胞毒性(李紅巖等,2001;2002).

由于它的高殺蟲性以及對哺乳動物、鳥類等的低毒性和低環(huán)境殘留量(Giri等,2002;Vijveberg和Berckey,1990)[4],氰戊菊酯[(RS)-α-氰基-3-苯氧基芐基-(RS)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸酯],是一種合成擬除蟲菊酯類農(nóng)藥,廣泛用于農(nóng)業(yè)(Saito等,2000),因此成為一種可能導致生態(tài)系統(tǒng)改變的長效水生污染物(Woin, 1998)[5].氰戊菊酯的殘留期為75～178天.氰戊菊酯在自然水體中對水生生物尤其魚類是危險的(Rozanski,1992).氰戊菊酯的毒性被廣泛研究于哺乳動物(De Souza Spinosa等,1999;Giri等, 2002;Hadnagy等,1999;Mandhane和Chopde, 1997[6];Singh和Jha,1996)以及淡水魚類(Kamalaveni等,2001;Radhaiah和Rao,1990;Reddy等, 1991).然而,氰戊菊酯對海水魚類以及他們的培養(yǎng)細胞的毒性效應知之甚少.在本研究中,FG-9307,一種來源于牙鲆Paralichthys O livaceus(童裳亮等, 1997)[7]的連續(xù)細胞系被用于氰戊菊酯的體外細胞毒性測定.

1 材料和方法

1.1 細胞和化學藥品

本實驗所用連續(xù)細胞系FG-9307來源于牙鲆鰓.細胞在20℃的基本培養(yǎng)基(MEM,Gibco BRL, New York)中培養(yǎng),添加了質量分數(shù)為10%的小牛血清(BCS,Hyclone,Utah),100國際單位/mL的青霉素,100μg/mL的鏈霉素.

氰戊菊酯,Ⅱ型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥,使用含20%有效成分的乳化液.用此乳化液而不是化學純物質是為了達到田間水平.乳化劑可以保護有效成分為離子態(tài),從而可降低毒性(Coats等,1989).小牛血清白蛋白(BSA),中性紅(NR),四唑鹽(MTT)均來自Sigma公司(StLouis,MO,USA).

1.2 實驗方法

1.2.1 氰戊菊酯對生長速度的影響

將匯合的細胞從25cm2培養(yǎng)瓶中收集,并用新鮮的質量分數(shù)10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基稀釋濃度至1×105個/mL.20000個細胞懸浮于200μL培養(yǎng)基加入96-孔板的每孔中,20℃孵育過夜.第二天棄去培養(yǎng)基,分別換上含0,5,10和15μg/mL氰戊菊酯的培養(yǎng)基.每個質量濃度做三個平行樣.每天用童等(1997)[7]的原位計數(shù)法測定細胞密度,以細胞數(shù)/mm2表示.

1.2.2 氰戊菊酯對細胞毒性分析

將匯合的細胞從25cm2培養(yǎng)瓶中收集,并用新鮮的含有10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基稀釋濃度至1×105個/mL.20000個細胞懸浮于200μL培養(yǎng)基加入96-孔板的每孔中,20℃孵育過夜.第二天,棄去培養(yǎng)基分別換上新鮮培養(yǎng)基(作對照)和含有不同濃度氰戊菊酯的培養(yǎng)基.每個濃度做三個平行樣.細胞培養(yǎng)48h后進行毒性檢測.

1)中性紅(NR)吸收實驗

方法參照Borenfreund和Puerner(1985)[2]檢測細胞生長所受的抑制,這是基于活細胞的溶酶體能夠吸收活體染料中性紅,而死細胞不能吸收這種染料的原理來進行的.

①經(jīng)過48h的處理后,輕輕移去舊培養(yǎng)基,每孔加入200μL在20℃預熱過夜的含50μg/mL中性紅的培養(yǎng)基.

②20℃孵育3h.

③移去中性紅溶液,加上預熱至20℃的磷酸緩沖液輕輕沖洗.

④移去磷酸緩沖液,加入200μL解析液(冰醋酸◇質量濃度96%乙醇◇水=1◇50◇49,體積比).

⑤室溫快速震蕩10min,用酶聯(lián)免疫儀在波長540nm處測定溶液的光吸收值.

⑥計算IC50值(即中性紅吸收被抑制50%的受試農(nóng)藥的濃度).

2)四唑鹽MTT檢測

參照Borenfreund等[2]的方法,基本原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物并沉積在細胞中,而死細胞則無此功能.

①經(jīng)過48h的處理后,每孔加入20μLMTT的PBS溶液(MTT質量濃度為5 mg/mL),20℃繼續(xù)培養(yǎng)4h;

②4h后,輕輕把溶液移去,加入預熱至20℃的PBS溶液,輕輕地快速漂洗2次;

③每孔加入150μL DMSO以溶解細胞中的紫色結晶物;

④用酶標儀在波長為490 nm處測定其光吸收值,計算其I C50值.

3)細胞總蛋白含量測定(cell protein assay)

細胞蛋白分析采用Shopsis和Eng的方法,是檢測經(jīng)污染物處理后的細胞總蛋白含量的方法.

①氰戊菊酯處理48h后,輕輕移去舊培養(yǎng)基.

②細胞用溫PBS輕輕漂洗后,加入50μL 0.1 mol/L的NaOH溶液裂解細胞.

③96-孔培養(yǎng)板20℃放置1h.

以上所有的實驗做3次,每一劑量的平均吸收值換算為對照組吸收值的百分比.

2 結 果

2.1 對細胞生長的抑制作用

當FG-9307細胞暴露于氰戊菊酯中,它的生長速度在所有的3個測試質量濃度中均被抑制,這是一個質量濃度依賴過程.對照細胞培養(yǎng)48h后細胞密度為1.32×103個/mm2,經(jīng)5,10,15μg/mL氯氰菊酯處理的細胞經(jīng)48h培養(yǎng)后細胞密度分別為1.19×103,0.88×103,0.70×103個/mm2.生長曲線也說明細胞的生長被氰戊菊酯抑制(見圖1).

圖1 氰戊菊酯對FG細胞生長曲線的影響

2.2氰戊菊酯對細胞毒性分析

NR,MTT和細胞蛋白分析法測定的氰戊菊酯對細胞毒性結果都是相似的,不因所采用的細胞毒性測試終點方法不同而不同,見圖2.實驗所用的最低質量濃度的氰戊菊酯1μg/mL就對細胞表現(xiàn)出明顯的毒性效應,并且毒性隨質量濃度的增大而增大,呈現(xiàn)出質量濃度依賴性.從圖2計算了NR,MTT和細胞蛋白分析法的I C50值,即48h內(nèi)引起細胞毒性參數(shù)受抑制程度達到50%時的氰戊菊酯的質量濃度,分別為15.68,16.49,16.66μg/mL.

圖2 氰戊菊酯對FG細胞體外細胞的毒性

3 討 論

氰戊菊酯可以濃度依賴方式抑制細胞的生長速度,由于細胞生長速度的計算容易操作,FG細胞是個方便快捷的體外檢測氰戊菊酯急性毒性的系統(tǒng).三種廣泛應用的測試終點方法——NR,MTT,細胞蛋白分析法表明三種測試系統(tǒng)的細胞毒性的相關性很高,并不因測試終點不同而不同.這與Ekwall的觀點——當用依賴于細胞基本結構和功能的不同測試終點檢測毒性時,大部分的細胞系對于毒物有類似的反應是吻合的.三種反應基于不同的毒性終點,中性紅是基于溶酶體膜損傷,MTT分析反映了對線粒體酶的抑制,細胞蛋白含量的降低可反映對細胞生長的抑制.細胞生長是貼壁的,細胞死亡可由脫壁表示,因此細胞蛋白的減少可作為一個表示細胞死亡的數(shù)量指標(Charles Shopsis和Ben Eng,1985).由于在氰戊菊酯的最低受試濃度1μg/mL對細胞就有毒性,這說明FG細胞對氰戊菊酯很敏感,FG細胞有可能成為檢測氰戊菊酯急性毒性的合適的生物指標.

據(jù)報道氰戊菊酯在濃度25μg/L時作用14天可使實驗的鯉魚全部死亡,一種擬除蟲菊酯農(nóng)藥permethrin對魚類的LC50在0.001～0.01mg/L范圍內(nèi)(H.Lutnika,1999)[8].而本實驗測得IC50值用NR,MTT和細胞蛋白分析法分別為15.68,16.49和16.66μg/mL.看來鰓上皮細胞是動物和它的水環(huán)境的重要屏障,因此是污染物的首要作用對象.體外魚類生態(tài)毒性評價方法的發(fā)展可促進探測及篩選水污染物的能力.

本文是首次報道海水魚類細胞系用于氰戊菊酯的體外細胞毒性測定.

[1]Babich H,Borenfreund E.In vitro cytotoxicity of organic pollutants to bluegill sunfish(BF-2)cells[J].Environmental Research,1987,42:229-237.

[2]Borenfreund E,PuernerJ A.Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neural red absorption[J]. Toxicol.Lett.,1985,24:119-124.

[3]Saito H, Iwami S,Shigeoka T.In vitro cytotoxicity of 45 pesticides to goldfish GF-Scale(GFS)cells[J].Chemosphere,1991,23:525-37.

[4]Vijverberg H P M.Neurotoxicological effects and the mode of action of pyrethroid insecticides[J].Crit Rev Toxicol., 1990,21:105-126.

[5]Woin P.Short-and long-term effects of the pyrethroid insecticide fenvalerate on an invertebrate pond community [J].Ecotoxicol Environ Saf.,1998,41(2):137-56.

[6]Mandhane SN,Chopde C T.Neurobehavioral effects of low level fenvalerate exposure in mice[J].Indian J Exp Biol., 1997,35(6):623-7.

[7]Tong SL,Li H,Miao H Z.The establishment and partial characterization of a continuous fish cell line FG-9307 from the gill of flounder Paralichihys Olivaceus[J].Aquaculture,1997,156:327-333.

[8]Lutnika H,Bogacka T,Wolska L.Degradation of pyrethroids in an aquatic ecosystem mode[J].Was.Res., 1999,33(16):3441-3446.

I n Vitro Cytotoxicity of the Pyrethroid I nsecticide Fenvalerate to the Flounder(ParalichthysOlivaceus)Gill Cells

LAN Xin

(Department ofBiochemistry,Qingdao Vocational and Technology College,Qingdao Shandong 266555,China)

The FG-9307 cell line derived from the gill of flounder Paralichthys olivaceuswas used to determine the cytotoxic effects of the pyrethroid pesticide,fenvalerate in the present study.The cell growth rate was markedly reduced by fenvalerate at the concentrationsof 5,10 and 15μg/mL tested.In addition,threewidely used endpoint assays,NR,MTT and cell protein assays,showed that the in vitro cytotoxicity of fenvalerate was closely correlated in all the systems independent of the toxic endpoints employed.These make the gill cell line a good candidate for deter mining the acute in vitro cytotoxicity of fenvalerate.

fenvalerate,flounder gill cell line,in vitro Cell

book=9,ebook=379

Q 2

A

1673-2103(2010)05-0074-04

2010-05-16

國家科技部863項目(2001AA649040)

蘭欣(1977-),女,四川成都人,講師,碩士,研究方向﹕生物技術與分子營養(yǎng)學.