史 穎，唐 潔，*，姚 開，曾朝懿，蔣珍菊（.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都60039；.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都60065）

氰戊菊酯降解菌的篩選與鑒定及其降解條件優(yōu)化

史 穎1，唐 潔1，*，姚 開2，曾朝懿1，蔣珍菊1
（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都610039；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065）

采用富集培養(yǎng)法從噴施擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的菜園土壤中，分離得到一株能降解氰戊菊酯的細(xì)菌BFE-023。經(jīng)生理生化和16S rDNA序列分析，將菌株BFE-023鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。應(yīng)用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了影響該菌株降解氰戊菊酯的主要影響因素，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了其降解條件。在優(yōu)化條件下，研究菌株BFE-023對氰戊菊酯的降解過程及其中間產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）的生成規(guī)律。結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)間和降解體系中氰戊菊酯濃度及氯化鐵含量是影響其降解的主要因素，優(yōu)化條件下60 h內(nèi)對氰戊菊酯降解率可達(dá)到88.71%，與所建立的模型預(yù)測值（88.78%）相吻合。菌株BEF-023降解氰戊菊酯的過程中，降解中間產(chǎn)物3-PBA的生成量呈現(xiàn)先明顯增加后逐漸減少的趨勢，說明菌株BEF-023可能具備繼續(xù)降解中間產(chǎn)物3-PBA的能力。

氰戊菊酯，生物降解，地衣芽孢桿菌，降解條件優(yōu)化

氰戊菊酯是應(yīng)用最早最普遍的一種擬除蟲菊酯類殺蟲劑，適用于棉花、果蔬、茶葉等作物以及林木、家畜、衛(wèi)生和倉儲等害蟲防治［1-2］。不論以何種方式將氰戊菊酯施用于果樹等農(nóng)作物，都會在土壤中殘留。研究表明，氰戊菊酯具有蓄積性［3］，雖然毒性相對較低，但是長期接觸即使是低劑量也會引起慢性疾?。?］，不可忽視的是，土壤中氰戊菊酯殘留量的持續(xù)增加勢必會造成環(huán)境污染和生態(tài)破壞。因此，尋找一種有效方法消除或降解環(huán)境中的氰戊菊酯農(nóng)藥殘留已成為當(dāng)前首要解決的問題。

近年來，隨著人們對生物修復(fù)理論（bioremediation）的不斷深入探索，因微生物對環(huán)境修復(fù)具有高效、廉價(jià)、安全、簡便等特點(diǎn)，使得微生物逐漸成為處理農(nóng)藥污染、泄漏事故污染以及生化武器等各種污染的最佳選擇［5］。目前，已通過富集培養(yǎng)、直接分離等技術(shù)，篩選得到了少量具有降解氰戊菊酯能力的微生物，如芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）［6］、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes sp.）［7］、微球菌屬（Micrococcus sp.）［8］、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas sp.）［9］、無色桿菌屬（Achromobacter sp.）［10］、曲霉屬（Aspergillus sp.）［11］和假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）［12］。已報(bào)道的氰戊菊酯降解菌大多只具有分解作用，甚至部分會產(chǎn)生具有更大環(huán)境危害性的中間降解產(chǎn)物。因此，獲得更多的氰戊菊酯降解菌對進(jìn)行生物修復(fù)研究和應(yīng)用具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)對篩選得到的一株氰戊菊酯降解菌進(jìn)行了菌株鑒定和降解條件優(yōu)化，并在優(yōu)化條件下對氰戊菊酯的降解過程和重要中間產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸的生成規(guī)律進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

99%氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)品 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；96%氰戊菊酯原農(nóng)藥 南京榮誠化工公司；98%3-苯氧基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品 TCI試劑公司；99.9%乙腈（色譜純） Adamas公司；99.5%乙酸乙酯、99%無水硫酸鈉成都市科龍化工試劑廠。

waters2695高效液相色譜儀、waters2998檢測器 上海沃特世科技有限公司；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A渦輪混合器 上海金鵬分析儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；冷凍離心機(jī)thermo；SKY-2102C空氣搖床 上?？茖W(xué)儀器有限公司；Powerpac Basic電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) Bio-RAD。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

1.2.1.1 基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（MM） （NH4）2SO41.5 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，MgSO40.2 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水1000 mL，pH7.5。

1.2.1.2 Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB） 胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5.0 g，NaCl 10 g，蒸餾水1000 mL，pH7.0。為使培養(yǎng)過程中微生物細(xì)胞與氰戊菊酯農(nóng)藥充分接觸，加入0.2%吐溫80（w/v）［13］，121℃滅菌20 min。液體培養(yǎng)基中加入2.0%（w/v）的瓊脂制成固體培養(yǎng)基。滅菌后加入不同體積氰戊菊酯工作液使其為實(shí)驗(yàn)所需的濃度。

1.2.2 菌樣采集 土壤樣品采集于施用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的菜園土壤，采樣深度為0～20 cm耕作層土壤，于無菌紙袋中取回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)自然風(fēng)干磨細(xì)，過2 mm篩備用。

1.2.3 氰戊菊酯和降解體系中3-苯氧基苯甲酸的檢測

1.2.3.1 氰戊菊酯的提取 取培養(yǎng)液1.0 mL并加入1.0 mL乙腈于具塞試管中，超聲波（40 kHz，100 W）輔助提取60 min，乙腈定容至10 mL，混勻后離心（13000 r/min）10 min，上清液用0.45 μm的有機(jī)相濾膜過濾，HPLC檢測［14］。

1.2.3.2 氰戊菊酯的HPLC檢測條件 色譜柱為Inertsil ODS-3（5.0 μm，150 mm×4.60 mm（i.d.）），流動相為乙腈-超純水（90∶10，v/v），流速為1.0 mL/min，柱溫為25℃，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.3.3 降解體系中3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）的提取 取制備的降解體系10 mL，于4℃、10000 r/min冷凍離心10 min；取無菌上清液，用2 mol/L鹽酸調(diào)整pH 至2，再加入等體積乙酸乙酯，渦旋振蕩器充分振搖萃取30 s，室溫靜置10 min；收集上層有機(jī)相，用無水硫酸鈉除水后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干；用1 mL甲醇復(fù)溶，上機(jī)檢測［15］。

1.2.3.4 3-PBA的HPLC檢測條件 色譜柱為Inertsil ODS-3（5.0 μm，150 mm×4.60 mm（i.d.）），流動相為乙腈-超純水（55∶45，v/v，磷酸調(diào)超純水pH2.5），流速為0.7 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量10 μL［14］。

1.2.3.5 氰戊菊酯和3-PBA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立 分別配制濃度為10 μg/mL的氰戊菊酯和3-PBA標(biāo)準(zhǔn)液，依次進(jìn)樣量分別為1、2、5、10、20、50 μL，即氰戊菊酯和3-PBA的質(zhì)量均為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg。擬合氰戊菊酯質(zhì)量-峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線和3-PBA質(zhì)量-峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.6 降解率的計(jì)算 根據(jù)所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品中氰戊菊酯和3-PBA的降解率。

降解率（%）=（1－C/C0）×100

式中，C—樣品液中氰戊菊酯或3-PBA質(zhì)量；C0—空白對照中氰戊菊酯或3-PBA質(zhì)量。

1.2.4 氰戊菊酯降解菌的篩選

1.2.4.1 降解菌株的富集馴化 取1 g土樣分別加入含氰戊菊酯50 mg/L的100 mL的LB培養(yǎng)基和MM培養(yǎng)基于30℃搖床（180 r/min）培養(yǎng)72 h后，取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至氰戊菊酯濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基和MM培養(yǎng)基中，再按上述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，按照上述操作連續(xù)轉(zhuǎn)接4次，并逐次提高培養(yǎng)基中氰戊菊酯的濃度直至其濃度提高到800 mg/L。

1.2.4.2 降解菌株的篩選和純化 馴化后，分別將菌懸液（OD600=1.0）進(jìn)行梯度稀釋涂布轉(zhuǎn)接到氰戊菊酯濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基平板。30℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落于含100 mg/L氰戊菊酯的LB培養(yǎng)基平板連續(xù)劃線純化三代，挑選出能耐受高濃度氰戊菊酯且菌落形態(tài)規(guī)則、生長速度較快的菌株，進(jìn)行傳代、涂布，直至LB培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)完全一致為止，挑取單菌落劃線培養(yǎng)后進(jìn)行編號，并用20%甘油于-70℃冷凍保存。

1.2.4.3 降解菌株對氰戊菊酯降解能力的測定 將分離得到的菌株制成菌懸液（OD600=1.0）按5.0%（v/v）的接種量分別接種于氰戊菊酯濃度為50 mg/L的兩種培養(yǎng)基（MM和LB）中，以不接菌接入相同體積的無菌水作為空白培養(yǎng)基，30℃振蕩（180 r/min）培養(yǎng)72 h，HPLC測定各菌株對氰戊菊酯的降解率，方法參照1.2.3，選取降解率高的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 氰戊菊酯降解菌的鑒定 生理生化特征參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第8版［16］。提取氰戊菊酯降解菌的DNA并以之為模板，采用常用的細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析［17］。

1.2.6 氰戊菊酯降解菌降解條件優(yōu)化

1.2.6.1 適宜氮源的選擇 將LB培養(yǎng)基中的胰蛋白胨替換成不同種類的氮源（蛋白胨、（NH4）2SO4、NH4NO3以及蛋白胨和（NH4）2SO4組合氮源）［18］，添加濃度均為1.0%（w/v）。LB培養(yǎng)基的其他成分不變，酵母浸出粉0.5%（w/v），NaCl 1.0%（w/v），pH7.0。

1.2.6.2 適宜碳源的選擇 除氰戊菊酯作為碳源外，將LB培養(yǎng)基中酵母浸出粉調(diào)整為0.1%，同時(shí)將其中的胰蛋白胨替換為適宜氮源（1.0%）。分別用0.1%可溶性淀粉、0.1%乳糖、0.1%葡萄糖、0.1%乙醇、0.1%甘油替換0.1%酵母浸出粉［18］，進(jìn)行外加碳源篩選。LB培養(yǎng)基的其他成分不變，NaCl 1.0%（w/v），pH7.0。

1.2.6.3 適宜無機(jī)鹽的選擇 根據(jù)碳、氮源篩選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，LB培養(yǎng)基中的胰蛋白胨和酵母浸出粉替換為適宜的氮源（1.0%）和碳源（0.1%），再分別添加不同種類無機(jī)鹽（CaCl2、CuSO4、MnSO4、ZnCl2、MgSO4、FeCl3）進(jìn)行適宜無機(jī)鹽篩選［19］，濃度均為0.05%（w/v），同時(shí)添加NaCl 1.0%（w/v），調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2.6.4 降解氰戊菊酯顯著影響因素的篩選 采用Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)［20］，分別以三組平行樣的氰戊菊酯降解率的平均值為響應(yīng)值，進(jìn)一步考察影響降解菌降解氰戊菊酯的因素，利用Minitab軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)其p值大小確定其主效應(yīng)因素，其他因素的取值則根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)效應(yīng)值（T）的正負(fù)和大小確定，T值為正值取高水平，T值為負(fù)值取低水平。

表1 因素水平表Table1 Table of factors and levels

1.2.6.5 降解菌降解氰戊菊酯優(yōu)化條件的確定 選用PB實(shí)驗(yàn)篩選得到的主效應(yīng)因素，通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)［21］快速逼近最佳氰戊菊酯降解區(qū)域，篩選最優(yōu)水平并建立因素水平表（見表1），采用Box-Behnken法，分別以三組平行樣的氰戊菊酯降解率（Y）的平均值為響應(yīng)值，建立有效的響應(yīng)面模型。分析主效應(yīng)因素間的交互作用，確定降解菌降解氰戊菊酯的優(yōu)化條件［21］。

1.2.7 優(yōu)化條件下氰戊菊酯的降解規(guī)律研究 依據(jù)

1.2.6 確定的優(yōu)化條件，將篩選得到的氰戊菊酯降解菌制成菌懸液（OD600=1.0）接種于優(yōu)化后的降解體系中（含0.2%的吐溫80（w/v）），每組制作三個(gè)平行，35℃以180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，采用HPLC法每隔8 h測定一次氰戊菊酯的降解率及3-PBA的生成量。通過對降解過程中氰戊菊酯的殘留量、3-PBA的生成量、菌體生物量OD600的平均值變化，研究菌株對氰戊菊酯降解以及中間產(chǎn)物3-PBA生成的規(guī)律。

2 結(jié)果與討論

2.1 氰戊菊酯和3-PBA的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

氰戊菊酯擬合所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y= 7682043.58x-9046.39。式中，y為峰面積，x為氰戊菊酯質(zhì)量（μg），線性范圍0.01～0.5 μg，其決定系數(shù)R2＞0.9999，表明線性關(guān)系良好。

3-PBA擬合所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=20974702.15x+40732.83。式中，y為峰面積，x為3-PBA質(zhì)量（μg），線性范圍0.01～0.5 μg，其決定系數(shù)R2＞0.9999，表明線性關(guān)系良好。

2.2 降解菌的鑒定

2.2.1 降解菌的形態(tài)及生理生化特性 菜園土壤中的微生物經(jīng)富集馴化，分離純化得到一株能夠降解氰戊菊酯的菌株，命名為BFE-023。菌株BFE-023在氰戊菊酯濃度為50 mg/L的LB和MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h降解率分別為70.81%和15.08%。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第8版［16］，對菌株BFE-023進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定。菌株BFE-023的形態(tài)結(jié)果顯示，該菌株的菌落扁平、呈白色、表面粗糙褶皺、邊緣不整齊，細(xì)胞形態(tài)和排列呈桿狀，其生理生化特征見表2。

表2 菌株BFE-023生理生化特征Table2 Physiological and biochemical characteristics of strain BFE-023

2.2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹 經(jīng)PCR擴(kuò)增的菌株BFE-023的16S rDNA片段長1366 bp，于GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊得到的登錄號為KP877123，經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，該菌株的16S rDNA與地衣芽孢桿菌相似度最高，選取數(shù)據(jù)庫中與其相似性達(dá)99%以上的菌株16S rDNA基因序列，運(yùn)用鄰法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征可鑒定該菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。地衣芽孢桿菌是一種土壤常見菌，也是腸道益生菌，近年來國內(nèi)對地衣芽孢桿菌降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的報(bào)道較多集中在其對氯氰菊酯的降解，如賴文等［22］分離得到地衣芽孢桿菌B-1可降解氯氰菊酯，并研究其培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)優(yōu)化條件及氯氰菊酯降解酶的分離純化；于曉菲等［23］研究了芽孢桿菌屬對高效氯氰菊酯的降解及碳源、氮源、溫度、pH和底物濃度對菌種降解高效氯氰菊酯能力的影響；劉芳芳等［24］分離得到了β-氯氰菊酯降解菌地衣芽孢桿菌B-1，并研究了表面活性劑對菌株降解β-氯氰菊酯的影響。目前，地衣芽孢桿菌對氰戊菊酯的降解還鮮有報(bào)道，因此，研究地衣芽孢桿菌BFE-023對氰戊菊酯的降解率具有重要意義。

圖1 菌株BFE-023系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain BFE-023

2.3 地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的優(yōu)化條件

2.3.1 最適氮源 將初始培養(yǎng)基中的胰蛋白胨替換成等量不同種類的其他氮源，地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的結(jié)果如圖2所示。可以看出，有機(jī)氮源（胰蛋白胨、蛋白胨）降解氰戊菊酯的效果比無機(jī)氮源（（NH4）2SO4、NH4NO3）和復(fù)合氮源（蛋白胨+（NH4）2SO4）效果好；說明充足的有機(jī)氮源有利于地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯，且有機(jī)氮源胰蛋白胨比蛋白胨對氰戊菊酯的降解率提高了3.66%。因此，選擇胰蛋白胨為地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的最適氮源。

圖2 不同氮源對地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on fenvalerate degradation by Bacillus licheniformis BFE-023

2.3.2 最適碳源 不同碳源對地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，酵母浸出粉對地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的效果最好，這是由于酵母浸出粉是一種多功能營養(yǎng)素，在培養(yǎng)基中不僅可以作為菌株生長的主要碳源，也能為菌株生長提供氮源和生長因子。胡尚勤等［25］研究發(fā)現(xiàn)適宜的碳源和氮源，維生素、礦質(zhì)元素有利于地衣芽孢桿菌的生長。在降解過程中，微生物的數(shù)量多少決定了該農(nóng)藥降解的速度和程度［26］。本實(shí)驗(yàn)中，酵母浸出粉增強(qiáng)了對微生物的刺激作用，提高了農(nóng)藥的降解率，因此，選擇酵母浸出粉為地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的最適碳源。

圖3 不同碳源對地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的影響Fig.3 Effect of different carbon resources on fenvalerate degradation by Bacillus licheniformis BFE-023

2.3.3 最適無機(jī)鹽 將初始LB培養(yǎng)基中的氮源和碳源替換成最適氮源和碳源（1.0%胰蛋白胨、0.5%酵母浸出粉，（w/v）后），分別添加0.05%（w/v）不同種類無機(jī)鹽，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，Zn2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ca2+對菌株BFE-023降解氰戊菊酯的能力較低，而Fe3+對氰戊菊酯的降解率最高，可能是因?yàn)镕e3+與有機(jī)質(zhì)螯合后，毒性會有所降低，或者Fe3+能作為某些降解酶的激活劑，而且其在菌體細(xì)胞呼吸中有著重要作用。因此，氯化鐵是地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯適宜的無機(jī)鹽。

圖4 不同無機(jī)鹽對地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的影響Fig.4 Effect of different inorganic salts on fenvalerate degradation by Bacillus licheniformis BFE-023

2.3.4 地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的主要影響因素 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，快速篩選可能影響地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的多個(gè)因素。PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其影響氰戊菊酯降解率的不同因素和水平的效應(yīng)分析如表3所示。由p值可以看出，氰戊菊酯濃度、氯化鐵含量、培養(yǎng)時(shí)間是9個(gè)因素中影響氰戊菊酯降解效果的比較顯著的因素，是主效應(yīng)因素。可以認(rèn)為，降解體系中濃度過高的氰戊菊酯會抑制菌株生長和酶促反應(yīng)初速度，而濃度過低會造成對降解酶的誘導(dǎo)不充分；少量的氯化鐵能促進(jìn)菌株的生長和某些降解酶的活性，過量的氯化鐵則會對菌株產(chǎn)生毒害作用，抑制酶促反應(yīng)速度；培養(yǎng)時(shí)間的長短和降解反應(yīng)直接相關(guān)。其他因素的取值則根據(jù)T值的正負(fù)和大小確定為：降解體系中胰蛋白胨含量1.25%（w/v）、酵母浸出粉含量0.125%（w/v）、接種量6.25%、培養(yǎng)溫度35℃、菌齡24 h、初始pH7.5。

表3 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其因素水平效應(yīng)分析Table3 Experiment design and analyses of Plackett-Burman

2.3.5 地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的響應(yīng)面中心點(diǎn) 依據(jù)影響氰戊菊酯降解效果的主要因素的正負(fù)效應(yīng)值設(shè)計(jì)的最陡爬坡實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果見表4。由此可知，第3組實(shí)驗(yàn)的氰戊菊酯降解率為77.70%，降解率最高，因此響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)確定為第3組的水平。

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table4 Experiment design and results of steepest ascent test

2.3.6 地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到該菌株的因素水平表及降解條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值（見表5）。通過對表5中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析建立二次響應(yīng)回歸模型，擬合得到氰戊菊酯降解率（Y）響應(yīng)曲面模型：

方差分析的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（見表6）表明，方程的F值（15.09）大于F0.01（9，5），說明方程在F0.01水平上顯著；失擬項(xiàng)p值（0.075）大于0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著。

為求得最大降解率，分別對模型的各自變量求一階偏導(dǎo)，令其為0，得出其極值點(diǎn)：X1=39.95，X2=60.19，X3=0.055%，即當(dāng)氰戊菊酯濃度為39.95 mg/L、培養(yǎng)時(shí)間為60.19 h、氯化鐵含量為0.055%（w/v）時(shí)，氰戊菊酯降解率的預(yù)測值為88.78%，為方便實(shí)際操作，將優(yōu)化條件校正為氰戊菊酯濃度為40 mg/L、培養(yǎng)時(shí)間為60 h、氯化鐵含量為0.055%（w/v）進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為88.71%，與預(yù)測值基本一致，說明特定條件下氰戊菊酯的降解率能夠準(zhǔn)確的被所建立的響應(yīng)面模型預(yù)測。

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table5 Results of Box-Behnken Experiment

表6 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table6 Variance analysis of the results from Box-Behnken test

2.4 地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的規(guī)律

地衣芽孢桿菌BFE-023降解氰戊菊酯的規(guī)律如圖5所示，在0～8 h時(shí)，降解體系中地衣芽孢桿菌BFE-023生物量迅速增加，而氰戊菊酯農(nóng)藥降解緩慢，降解率僅為3.68%，是由于此階段降解體系中充足的碳源和氮源最大限度的促進(jìn)了菌株的生長，氰戊菊酯對菌株BFE-023的誘導(dǎo)作用尚未體現(xiàn)，因此降解率較?。?7］。在8～32 h培養(yǎng)時(shí)間段，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，地衣芽孢桿菌BFE-023生物量趨于最大值，降解體系中容易被利用的外加碳、氮源逐漸被消耗，氰戊菊酯在降解體系中對菌株BFE-023的影響逐漸增大，地衣芽孢桿菌BFE-023在此環(huán)境中逐步受母體農(nóng)藥氰戊菊酯的誘導(dǎo)產(chǎn)生了降解酶，氰戊菊酯開始迅速降解，此時(shí)降解速率達(dá)到最大。在32～48 h培養(yǎng)過程中，氰戊菊酯農(nóng)藥降解速率減緩，一方面可能是此階段地衣芽孢桿菌BFE-023的生長逐步進(jìn)入衰亡期，另一方面可能是降解體系中氰戊菊酯的濃度逐漸減少，地衣芽孢桿菌BFE-023受環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)降解酶的速率降低，同時(shí)氰戊菊酯降解生成的部分降解中間產(chǎn)物可能抑制了菌株BFE-023對母體農(nóng)藥氰戊菊酯的降解能力，從而使降解率減?。?7］。

3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）是氰戊菊酯農(nóng)藥降解過程中的重要中間產(chǎn)物，其在培養(yǎng)過程中的生成量如圖5所示，在培養(yǎng)初期，由于氰戊菊酯降解率低，因此3-PBA的生成量比較低，為0.081 μg/mL。在8～32 h培養(yǎng)時(shí)間段，隨著氰戊菊酯農(nóng)藥的快速降解，3-PBA也大量生成，并于28 h達(dá)到最大累積量為2.455 μg/mL；但培養(yǎng)到30 h后，3-PBA的含量出現(xiàn)緩慢下降趨勢，可能是降解體系中地衣芽孢桿菌BFE-023受一定濃度3-PBA的誘導(dǎo)產(chǎn)生3-PBA降解酶，使3-PBA進(jìn)一步降解成小分子物質(zhì)，說明菌株BEF-023可能具備繼續(xù)降解中間產(chǎn)物3-PBA的能力。

圖5 氰戊菊酯的殘留量、3-苯氧基苯甲酸的累積量及菌體生物量OD600的變化規(guī)律Fig.5 Residues fenvalerate，the cumulative amount of 3-PBA and variation of bacterial biomass OD600

3 結(jié)論

從噴施擬除蟲菊酯農(nóng)藥的菜園土壤中分離得到的一株能降解氰戊菊酯的菌株BFE-023，經(jīng)生理生化和16S rDNA序列分析鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。菌株BFE-023降解氰戊菊酯農(nóng)藥的效果受多種因素的影響，其中培養(yǎng)時(shí)間、降解體系中的氰戊菊酯濃度及氯化鐵含量是其主要影響因素。依據(jù)所建立的響應(yīng)面模型確定該菌株降解氰戊菊酯的優(yōu)化條件經(jīng)校正為：培養(yǎng)基中氰戊菊酯濃度40 mg/L、培養(yǎng)時(shí)間為60 h、氯化鐵含量為0.055%（w/v）、胰蛋白胨含量1.25%（w/v）、酵母浸出粉含量0.125%（w/v）、接種量6.25%（w/v）、培養(yǎng)溫度35℃、菌齡24 h、初始pH7.5。在此優(yōu)化條件下，氰戊菊酯的平均降解率為88.71%，與預(yù)測值基本一致。

在優(yōu)化條件下，對降解體系中氰戊菊酯的降解情況和中間產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）的生成及菌體生物量OD600的變化規(guī)律進(jìn)行研究，結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌BFE-023不僅在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了降解氰戊菊酯的關(guān)鍵酶，使氰戊菊酯快速降解，還可能具有對中間產(chǎn)物3-PBA一定的降解能力。由于地衣芽孢桿菌BFE-023對氰戊菊酯的降解與菌株分泌的降解酶有關(guān)，因此其降解途徑和機(jī)理有待于進(jìn)一步研究探討。研究結(jié)論不僅豐富了氰戊菊酯降解菌資源庫，還對進(jìn)一步研究氰戊菊酯的降解途徑及機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

［1］GIRI S，SHARMA G D，GIRI A，et al.Fenvalerate-induced chromosome aberrations and sister chromatid exchanges in the bone marrow cells of mice in vivo［J］.Mutat Res，2002，520（1-2）：125-132.

［2］TRIPATHI G，VERMA P.Fenvalerate-induced changes in a catfish.clarias batrachus：Metabolic enzymes，RNA and protein ［J］.C-omp Biochem Physiol，C：Pharmacol Toxicol，2004，138 （1）：75-79.

［3］Al-Makkawy H K，Madbouly MD.Persistence and accumulation of some organic insecticides in Nile water and fish resources［J］.Conservation and Recycling，1999，27（1-2）：105-115.

［4］Kolaczinski J H，Curtis C F.Chronic illness as a result of low-level exposure to synthetic pyrethroid insecticides：A review of the debate［J］.Food and Chemical Toxicology，2004，42（5）：697-706.

［5］Singh B K，Walker A.Microbial degradation of organophorus compounds［J］.FEMS Microbiology Reviews，2006，30（3）：428-471.

［6］Maloney S E，Maule A，Smith A R.Purification and preliminary characterization of permethrinase from a pyrethroid-transforming strain of Bacillus cereus［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59（7）：2007-2013.

［7］虞云龍，陳鶴鑫，樊德方，等.擬除蟲菊酯類殺蟲劑的酶促降解［J］.環(huán)境科學(xué)，1998，19（3）：66-69.

［8］Tallur P N，Megadi V B，Ninnekar H Z.Biodegradation of cypermethrin by Micrococcus sp.strain CPN1［J］.Biodegradation，2008，19（1）：77-82.

［9］Guo P，Wang B Z，Hang B J，et al.Pyrethroid degrading Sphingobium sp.JZ-2 and the purication and characterization of a novel pyrethroid hydrolase［J］.International Biodeterioration＆Biodegradation，2009，63（8）：1107-1107.

［10］虞云龍，宋風(fēng)鳴，鄭重，等.一株廣譜農(nóng)藥降解菌（Alcaligenes sp）分離與鑒定［J］.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，23 （2）：111-115.

［11］Liang W Q，Wang Z Y，Li H，et al.Purification and characterization of a novel pyrethroid hydrolase from Aspergillus niger ZD11［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（19）：7415-7420.

［12］田盼.氰戊菊酯降解菌的篩選及其降解酶的初步純化［D］.福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2009.

［13］劉書亮，姚開，賈冬英，等.HPLC法檢測米曲霉降解體系中氯氰菊酯前處理方法的研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，43（4）：179-183.

［14］Jie Tang，Kai Yao，Shuliang Liu，et al.Biodegradation of 3-phenoxybenzoic acid by a novel sphingomonas sp.SC-1［J］.Fresenius Environmental Bulletin，2013，22（5a）：1564-1572.

［15］Chen S，Luo J，Hu M，et al.Enhancement of cypermethrindegradation by a coculture of Bacillus cereus ZH-3 and Streptomyces aureus HP-S-01［J］.Bioresource Technology，2012，110（2）：97-104.

［16］布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊［M］.第8版.中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》翻譯組，譯.北京：科學(xué)出版社，1984：729-732.

［17］劉君寒，王兆守，何健，等.一株氯氰菊酯降解菌的分離和鑒定［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（3）：68-72.

［18］顧寶群.氯氰菊醋降解菌的篩選及降解特性研究［D］.南寧：廣西大學(xué)，2006.

［19］張麗萍，徐蓮，吳瑩，等.氯氰菊酯降解菌的篩選鑒定及其降解特性研究［J］.生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2009，25（3）：67-72.

［20］Reddy L，Wee Y J，Yun J S，et al.Optimization of alkaline protease production by batch culture of Bacillus sp.RKY3 through Plackett-Burman and response surface methodological approaches［J］.Bioresource Technology，2008，99（7）：2242-2249.

［21］閻金勇，楊江科，閆云君.單因子-響應(yīng)面法優(yōu)化白地霉Y162產(chǎn)脂肪酶條件［J］.中國生物工程雜志，2007，27（8）：69-75.

［22］賴文.氯氰菊酯降解菌的篩選、降解條件優(yōu)化及其酶純化研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［23］于曉菲，夏清風(fēng)，金朝霞.高效氯氰菊酯降解菌的篩選及其降解特性［J］.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32（6）：417-421.

［24］劉芳芳，遲原龍，喻志強(qiáng)，等.表面活性劑對地衣芽孢桿菌B-1降解β-氯氰菊酯的影響［J］.食品科技，2015，40（1）：10-13.

［25］胡尚勤，劉天貴.地衣芽孢桿菌營養(yǎng)要求的研究［J］.河北省科學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，17（4）：224-227.

［26］方曉航，仇榮亮.農(nóng)藥在土壤環(huán)境中的行為研究［J］.土壤與環(huán)境，2002，11（1）：94-97.

［27］秦坤，朱魯生，王金花.氯氰菊酯降解真菌的篩選及其降解特性研究［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2010，4（4）：950-954.

Isolation and characterization of fenvalerate degrading strain and optimization of degradation conditions

SHI Ying1，TANG Jie1，*，YAO Kai2，ZENG Chao-yi1，JIANG Zhen-ju1
（1.School of Food and Biotechnology，Xihua University，Chengdu 610039，China；2.College of Light Industry and Food，Sichuan University，Chengdu 610065，China）

Bacterial strain BFE-023 with high ability to degrade fenvalerate was isolated from garden soil which contaminated by pyrethroid pesticides.According to physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence，the bacterial strain was identified as Bacillus licheniformis.The main factors influencing fenvalerate degradation were confirmed by using Plackett-Burman design，and the degradation condition was optimized with response surface method.Under the optimal conditions，the degradation of fenvalerate and the generation of 3-phenoxy benzoic acid（3-PBA）were researched.The results showed that fenvalerate concentration，incubation time and ferric chloride content were the major factors which influencing fenvalerate degradation.In addition，the degradation rate of fenvalerate under the optimized conditions in 60 h reached 88.71%，which was similar to predictive value from response surface model（88.78%）.The concentration of 3-PBA in the degradation system of fenvalerate was increased obviously at first and then decreased gradually.It was proved that the strain BFE-023 could degrade the intermediate 3-PBA.

fenvalerate；biodegradation；Bacillus licheniformis；optimization of degradation conditions

TS201.3

A

1002-0306（2016）02-0217-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.036

2015－05－22

史穎（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全，E-mail：1215481052@qq.com。

*通訊作者：唐潔（1982-），女，副教授，研究方向：食品安全，E-mail：tangjie1225@mail.xhu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371775）；四川省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目（114ZB0122）；西華大學(xué)人才培養(yǎng)重點(diǎn)項(xiàng)目（z1310525）；四川省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（szjj2014-011）；西華大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目基金（ycjj2015023）。