王 婧，鄧辰辰，徐振秋，畢宇安，王振中（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港222001；2.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港222001）

瑪咖總生物堿檢測(cè)方法的建立及提取優(yōu)化

王 婧1，2，鄧辰辰1，2，徐振秋1，2，畢宇安1，2，王振中1，2
（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港222001；2.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港222001）

建立瑪咖總生物堿含量的測(cè)定方法，對(duì)不同產(chǎn)地的瑪咖總生物堿含量進(jìn)行比較研究。以氧化苦參堿作為對(duì)照品，篩選酸性染料比色法條件，并利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化樣品處理方法，建立測(cè)定方法。結(jié)果酸性染料比色法的條件為緩沖液（pH=3.5）加入量3 mL，溴甲酚綠加入量3 mL，測(cè)定波長(zhǎng)為412 nm；最佳樣品處理?xiàng)l件為液料比23∶1（mL/g）、提取溫度82℃、提取時(shí)間2.1 h。此條件下，云南黃色瑪咖的總生物堿含量為1.3 mg/g，在五種瑪咖中，西藏黑瑪咖的總生物堿含量最高為8.4 mg/g。此法操作簡(jiǎn)便、精密度高、穩(wěn)定性好、具良好的可重復(fù)性，可用于瑪咖中總生物堿的含量測(cè)定。

酸性染料比色法，瑪咖，響應(yīng)面，總生物堿

瑪咖（Lepidium meyenii Walp）為十字花科草本生植物，原產(chǎn)于秘魯，現(xiàn)今西藏等高原地區(qū)已經(jīng)成功引種瑪咖。瑪咖具有抗疲勞、抗氧化、減少前列腺增生、緩解更年期綜合癥、改善性功能等功效［1］?，斂е泻胸S富的蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物及微量元素，還含有特有的瑪咖酰胺、瑪咖烯等酰胺類生物堿次生代謝物質(zhì)［2-3］。生物堿是多存在于植物體內(nèi)的一類含氮的堿性有機(jī)物，目前從瑪咖中得到的生物堿主要有以下幾類：瑪咖酰胺和瑪咖烯、羥基吡啶衍生物類、B-咔啉生物堿、咪唑生物堿［4-7］?，斂飰A是瑪咖中主要功效物質(zhì)之一，研究表明，瑪咖生物堿能全面調(diào)理人體肌能，平衡內(nèi)分泌［4，8］，具有抗氧化、抗腫瘤［9-10］及提高動(dòng)物成熟卵泡小體的數(shù)量和精子的質(zhì)量，從而可顯著提高哺乳動(dòng)物生育力［11］。

常用的生物堿含量測(cè)定方法有酸堿滴定法、分光光度計(jì)法、比色法等。由于提取物中生物堿數(shù)目多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)其總生物堿含量測(cè)定較多使用酸堿滴定法或酸性染料比色法，其中酸堿滴定法對(duì)含有一定色素的生物堿測(cè)定準(zhǔn)確性欠缺，酸性染料比色法近年來(lái)應(yīng)用較多，常用其測(cè)定總生物堿的含量，結(jié)果較為準(zhǔn)確［12-15］。本實(shí)驗(yàn)以氧化苦參堿為對(duì)照品，采用酸性染料比色法，建立瑪咖總生物堿含量測(cè)定方法，并比較了不同產(chǎn)地、不同品種瑪咖中總生物堿的含量。

生物堿大多采用溶劑提取法，常用的提取方法主要有水或酸水提取法、醇類溶劑提取法等，其提取方式主要有浸漬法、煎煮法、熱回流法、超聲提取法等［16］。目前瑪咖總生物堿提取主要以醇類為提取溶劑，輔助超聲波或回流等條件，現(xiàn)有文獻(xiàn)缺乏對(duì)瑪咖中總生物堿的提取工藝優(yōu)化研究，本文采用響應(yīng)面優(yōu)化樣品前處理方法，建立適宜的瑪咖總生物堿提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑪咖超微粉 西藏產(chǎn)黃色瑪咖、紫色瑪咖、黑色瑪咖，云南產(chǎn)黃色瑪咖，秘魯產(chǎn)黑色瑪咖；氧化苦參堿對(duì)照品 中國(guó)食品藥品檢定研究院；其他試劑 均為分析純；水 超純水。

UV-2700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津；TDL-5-A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；MP511 型pH計(jì) 上海三信儀表廠；FA1004電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 瑪咖總生物堿提取液的制備 稱量瑪咖超微粉2 g，加20倍量純水，以80℃水浴提取2 h，提取液4000 r/min離心15 min，收集上清液減壓濃縮至1/4體積得濃縮浸膏，以10 mL 2%的鹽酸溶解，過(guò)濾，殘?jiān)?0 mL 2%的鹽酸溶解，合并濾液。用濃氨水調(diào)節(jié)濾液pH至2～3，等體積氯仿萃取三次。將酸提取液用5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9～10，等體積氯仿萃取三次，合并萃取液，蒸發(fā)濃縮至10 mL，即得瑪咖總生物堿提取液［17］。

1.2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的氧化苦參堿對(duì)照品20.56 mg，置于200 mL容量瓶中，加氯仿稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1028 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

1.2.1.3 酸性染料的配制 取0.1 g溴甲酚綠粉末，于研缽中，加入2.8 mL的0.05 mol/L NaOH，研磨至粉末充分溶解后，加入200 mL的蒸餾水稀釋，移入具塞的廣口瓶中備用。

1.2.1.4 鄰苯二甲酸鹽緩沖液的配制 取鄰苯二甲酸氫鉀10 g，加水900 mL，攪拌使溶解，用NaOH溶液（或稀鹽酸）調(diào)節(jié)pH，加水稀釋至1000 mL，混勻，即得。

1.2.2 瑪咖總生物堿檢測(cè)——酸性染料比色法的建立

1.2.2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別精密吸取氧化苦參堿對(duì)照品溶液0.50 mL和瑪咖總生物堿提取液0.1 mL，加入鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液（pH=4.0）5 mL，溴甲酚綠溶液2 mL于分液漏斗中，振搖1 min，以三氯甲烷10 mL萃取，靜置1 h，使水層和三氯甲烷層分清后，向分出的氯仿層加入0.20 g無(wú)水硫酸鈉，分別在300～600 nm進(jìn)行掃描。

1.2.2.2 顯色劑用量的選擇 精密吸取氧化苦參堿對(duì)照品溶液0.50 mL，加入鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液（pH=4.0）5 mL，分別加入溴甲酚綠顯色劑1、2、3、4、5、6、7 mL于分液漏斗中，其余步驟按1.2.2.1法操作，同時(shí)以三氯甲烷做為空白溶液，于412 nm處測(cè)定其吸光度值。

1.2.2.3 緩沖液pH的選擇 精密吸取氧化苦參堿對(duì)照品溶液0.50 mL，分別加入pH為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的鄰苯二甲酸氫鉀鹽緩沖液5 mL，及溴甲酚綠溶液3 mL于分液漏斗中，其余步驟按1.2.2.1法操作，同時(shí)以三氯甲烷做為空白溶液，于412 nm處測(cè)定其吸光度值。

1.2.2.4 緩沖液用量的選擇 精密吸取氧化苦參堿對(duì)照品溶液0.50 mL，分別加入鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液（pH=3.5）2、3、4、5、6、7、8 mL，及溴甲酚綠溶液3 mL于分液漏斗中，其余步驟按1.2.2.1法操作，同時(shí)以三氯甲烷做為空白溶液，于412 nm處測(cè)定其吸光度值。

1.2.3 酸性染料比色法的方法學(xué)考察

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別準(zhǔn)確吸取氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，以氯仿定容至1 mL，分別取鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液（pH=3.5）3 mL，及溴甲酚綠溶液3 mL于分液漏斗中，振搖1 min，以三氯甲烷10 mL萃取，靜置1 h，使水層和三氯甲烷層分清后，取氯仿層加入0.20 g無(wú)水硫酸鈉，同時(shí)以三氯甲烷做為空白溶液，于412 nm處測(cè)定其吸光度值。以氧化苦參堿含量為縱坐標(biāo)，以吸光度值為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.20、0.50、0.80 mL，以氯仿定容至1 mL，其余步驟按1.2.3.1法操作，平行測(cè)定6次吸光度值。

1.2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取瑪咖總生物堿提取液0.1 mL，分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h依法測(cè)定吸光度值。

1.2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取瑪咖超微粉6份各約2.0 g，按供試品制備項(xiàng)下方法制備，精確吸取供試液0.1 mL，其余按1.2.3.1操作，平行測(cè)定6次吸光度值。

1.2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取瑪咖超微粉6份各約1.0 g，分別加入氧化苦參堿對(duì)照品溶液適量，按供試品制備項(xiàng)下方法制備。精確吸取供試液0.1 mL，其余按1.2.3.1操作，于412 nm處測(cè)吸光度值，計(jì)算回收率。

1.2.4 瑪咖生物堿的提取優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 按液料比20∶1（mL/g）取對(duì)應(yīng)體積純水、甲醇、乙醇分別加入瑪咖超微粉中，水浴提取2 h，按照1.2.1.1項(xiàng)下方法制得供試品溶液，測(cè)定吸光度值。同時(shí)考察純水液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）對(duì)瑪咖中總生物堿得率的影響。

按液料比20∶1（mL/g）取對(duì)應(yīng)體積純水加入瑪咖超微粉中，每次水浴提取2 h，分別考察提取溫度50、60、70、80、90℃對(duì)瑪咖中總生物堿得率的影響。

按液料比20∶1（mL/g）取對(duì)應(yīng)體積純水加入瑪咖超微粉中，提取溫度80℃，分別考察水浴提取1、2、3、4、5 h對(duì)瑪咖中總生物堿得率的影響。

總生物堿得率（%）=［比色液生物堿含量（mg）×供試品溶液體積（10 mL）］/［比色液中供試品溶液體積（0.1 mL）×供試品質(zhì)量（g）×103］×100

1.2.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和單因素實(shí)驗(yàn)，確定各因素的取值水平范圍，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 The experimental factors and levels of response surface methodology

1.2.5 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地、不同種類5種瑪咖超微粉，每種平行操作3次，以優(yōu)化后的處理方法進(jìn)行供試品制備，分別精密吸取0.1 mL，其余步驟按照

1.2.3.1 法測(cè)定，記錄吸光度值并計(jì)算總生物堿含量，以氧化苦參堿計(jì)。以響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)組合進(jìn)行生物堿的提取，比較5種瑪咖的總生物堿含量。

總生物堿含量（mg/g）=［比色液生物堿含量（mg）×供試品溶液體積（10 mL）］/［比色液中供試品溶液體積（0.1 mL）×供試品質(zhì)量（g）］

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性染料比色法的確定

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)在412 nm處溴甲酚綠與標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液中的總生物堿形成的絡(luò)合物均具有穩(wěn)定吸收，故選412 nm為其檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 紫外-可見(jiàn)吸收?qǐng)D譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra

2.1.2 顯色劑用量的確定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，顯色劑用量為3 mL時(shí)，氧化苦參堿照品與顯色劑形成的絡(luò)合物有最大吸光度值，因此確定溴甲酚綠顯色劑用量為3 mL。

2.1.3 緩沖液 pH的確定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，氧化苦參堿對(duì)照品在緩沖液pH3.5處有最大吸光度值，因此選pH3.5為緩沖溶液的pH。

2.1.4 緩沖液用量的確定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，氧化苦參堿對(duì)照品在緩沖液用量為3 mL處有最大吸光度值，因此選緩沖液的用量為3 mL。

圖2 不同顯色劑用量下的吸光度Fig.2 Absorbance of the different amount of reagent

圖3 不同緩沖液pH下的吸光度Fig.3 Absorbance of the different amount of color buffer pH

圖4 不同緩沖液用量下的吸光度Fig.4 Absorbance curve of different the amount of buffer

2.2 酸性染料比色法的方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 經(jīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，得出回歸方程y=6.5695x-0.0004，R2=0.9996。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 采用同樣方法連續(xù)測(cè)定同一濃度樣品6次，吸光度RSD為1.65%（n=18），表明精密度符合要求。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 依法測(cè)得不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值，結(jié)果吸光度RSD為0.68%，表明在3 h內(nèi)吸光度值穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表2，依法測(cè)得6批樣品吸光度，結(jié)果平均總生物堿含量為2.7 mg/g，RSD值為1.79%，可知本法重復(fù)性良好，符合含量測(cè)定的要求。

2.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表3，平均回收率為95.67%，RSD為2.01%。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table2 Results of the reproducibity test（n=6）

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table3 Results of the recovery test（n=6）

2.3 瑪咖總生物堿提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 不同介質(zhì)對(duì)瑪咖總生物堿提取量的影響Fig.5 Effect of different medium on extraction rate

圖6 液料比對(duì)瑪咖總生物堿提取量的影響Fig.6 Effect of liquid/solid ratio on extraction rate

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 比較不同提取方式對(duì)瑪咖總生物堿得率的影響，由圖5可見(jiàn)水＞甲醇＞乙醇。而后考察不同比例水對(duì)其影響，結(jié)果見(jiàn)圖6～圖8，液料比20（mL/g）純水，80℃水浴2 h能最大限度提取瑪咖超微粉中總生物堿。適量的提取溶劑充分保證總生物堿提取得率最高，而提取溶劑過(guò)多會(huì)增加后續(xù)萃取等處理步驟損失率。隨著溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，從而提高提取得率，由于瑪咖酰胺等生物堿在高溫下不穩(wěn)定，其結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生分解，因此隨后繼續(xù)增加溫度，生物堿得率反而降低。隨著提取時(shí)間的增加，提取率先上升后降低，其原因在于生物堿溶出量在一定時(shí)間點(diǎn)達(dá)到飽和狀態(tài)，其提取率達(dá)到平衡，進(jìn)一步增加提取時(shí)間，其生物堿發(fā)生分解變化。

圖7 提取溫度對(duì)瑪咖總生物堿提取量的影響Fig.7 Effect of temperatures on extraction rate

圖8 提取時(shí)間對(duì)瑪咖總生物堿提取量的影響Fig.8 Effect of extraction time on extraction rate

2.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Box-Benhnken experimental design and results

2.3.2.1 響應(yīng)面分析 采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，以總生物堿得率為響應(yīng)值的回歸方程：Y=0.26+0.047A+3.750E-003B+0.039C+0.028AB+0.018AC-5.000E-003BC-0.080A2-0.067B2-0.078C2。模型方差分析結(jié)果表明（見(jiàn)表4、表5），該模型F值為96.10（p＜0.0001），說(shuō)明回歸模型極顯著。失擬項(xiàng)p= 0.8859＞0.05，表明該模型選擇合理，可以用回歸方程對(duì)配方進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。該方程相關(guān)系數(shù)為0.11/ 0.12=91.67%，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有91.67%來(lái)源于所選變量。綜上說(shuō)明該模型方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳前處理工藝條件。

表5 回歸統(tǒng)計(jì)分析表Table5 Analysis of variance for the fitted regression model

從三因素對(duì)瑪咖總生物堿得率的影響來(lái)看，液料比（A）和提取時(shí)間（C）的影響極顯著（p＜0.01），AB 及AC的交互項(xiàng)回歸系數(shù)均顯著（p＜0.01或p＜0.05），表明液料比、提取溫度及提取時(shí)間有一定的交互作用，而其他項(xiàng)之間的影響不顯著除。由F值的大小可以推斷，在所選擇的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，3個(gè)因素對(duì)瑪咖總生物堿得影響的排序?yàn)橐毫媳龋ˋ）＞提取時(shí)間（C）＞提取溫度（B）。從交互作用來(lái)看，AB＞AC＞BC。

比較三維響應(yīng)面圖（圖9），液料比與提取溫度的交互作用響應(yīng)曲面圖的等高線為橢圓形，說(shuō)明因素間交互作用對(duì)瑪咖總生物堿得率的影響極顯著，其曲線較陡峭；液料比與提取時(shí)間的影響相比次之，其曲線較為平滑。比較響應(yīng)面三維圖可知，在所選范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)面最高點(diǎn)。通過(guò)以上分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于瑪咖總生物堿得率，提取時(shí)間和提取溫度的影響比較明顯，當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間提取及溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)破壞生物堿結(jié)構(gòu)，從而使瑪咖總生物堿得率下降。

2.3.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)，對(duì)二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型的解逆矩陣，求出最佳提取條件：液料比23.38∶1、提取溫度81.69℃，提取時(shí)間2.11 h，此時(shí)生物堿含量可達(dá)0.27%。校正后的實(shí)驗(yàn)條件為液料比23∶1、提取溫度82℃，提取時(shí)間2.1 h，此時(shí)咖總生物堿的平均含量為0.29%±0.09%。與理論預(yù)測(cè)值基本吻合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化效果顯著，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得回歸方程具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

圖9 各兩因素交互作用的響應(yīng)面Fig.9 Response surface of all two factor interactive effects on extraction yield of total alkaloids

2.4 不同產(chǎn)地瑪咖中總生物堿含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地、不同種類的瑪咖測(cè)定含量，表6結(jié)果顯示，各產(chǎn)地瑪咖總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有一定差異，西藏黑瑪咖含量最高，云南黃瑪咖含量最低。

表6 不同產(chǎn)地、不同品種瑪咖總生物堿含量Table6 Maca total alkaloid content of diffent regions，diffent varieties

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)酸性染料比色法和樣品前處理進(jìn)行了比較詳細(xì)的研究，確定了最佳比色條件為緩沖液（pH=3.5）加入量3 mL，溴甲酚綠加入量3 mL，測(cè)定波長(zhǎng)為412 nm；確定了最佳樣品處理?xiàng)l件為液料比23∶1（mL/g）、提取溫度82℃、提取時(shí)間2.1 h。此方法快速簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確易行，可用于瑪咖中總生物堿的含量測(cè)定。

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Establishment of content determination and optimization extraction condition of total alkaloids in Maca

WANG Jing1，2，DENG Chen-chen1，2，XU Zhen-qiu1，2，BI Yu-an1，2，WANG Zhen-zhong1，2
（1.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.，Ltd.，Lianyungang 222001，China；2.State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process，Lianyungang 222001，China）

To establish a method for the assay of the total alkaloids in Maca，and investigate the contents from different origins.With the oxymatrine as reference，the method was established by purified acid dye colorimetry and optmized the extraction condition by response surface method.Acid dye colorimetric conditions was as follows:adding pH3.5 buffer 3 mL and bromocresol green colour reagent 3 mL，then detemining at the wavelength 412 nm.The optimal extraction conditions was found to be ratio of liquid to solid 23∶1（mL/g），temperature 82℃，time 2.1 h.The extraction efficiency of total alkaloids from Yunnan yellow Maca under these conditions was 1.3 mg/g compared to 8.4 mg/g from Tibet black Maca，highest among the five species investigated.This method was simple，highly sensitive，accurate and reproducible，which could be used for determination of the total alkaloids in Maca.

adid dye colorimetry；MACA；response surface；total alkaloids

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0073-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.006

2015－05－29

王婧（1984-），女，碩士，中級(jí)工程師，研究方向：功能性保健食品研究與開(kāi)發(fā)，E-mail：annaliliwin@163.com。