相啟森，張麗華，姜亭亭，張文杰，李銀麗，申瑞玲，*（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450002）

藜麥提取物體外抗氧化活性研究

相啟森1，2，張麗華1，2，姜亭亭1，2，張文杰1，2，李銀麗1，2，申瑞玲1，2，*
（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450002）

以產(chǎn)自山西的藜麥為研究對象，以對DPPH·和ABTS+·的清除能力、鐵還原力等為指標，評價了其提取物的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，藜麥提取物對DPPH·和ABTS+·均有較強的清除能力，其IC50分別為（43.13±2.41）mg/mL和（27.91±1.46）mg/mL；FRAP法測得藜麥抗氧化能力為（1.90±0.10）mg FeSO4/g；此外，藜麥提取物能夠有效抑制自由基引發(fā)的亞油酸過氧化和牛血清白蛋白氧化降解。藜麥提取物具有較強的體外抗氧化活性，為其體內(nèi)抗氧化活性的研究奠定了基礎(chǔ)。

藜麥，抗氧化活性，自由基清除能力，鐵還原能力

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）又名昆諾阿藜、南美藜等，是一種原產(chǎn)于南美洲安第斯山地區(qū)的一年生藜科草本植物，已有5000多年的種植歷史［1-2］。藜麥含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、礦質(zhì)元素等營養(yǎng)素并富含植物化學(xué)物質(zhì)，具有很高的食用價值，被古印加人稱為“糧食之母”［3］。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）認為藜麥是唯一的單一植物即可基滿足人體基本營養(yǎng)需求的食物。鑒于藜麥具有很高的營養(yǎng)價值，聯(lián)合國大會將2013年定為“國際藜麥年”，旨在讓世界關(guān)注藜麥的生物多樣性和營養(yǎng)價值。目前，藜麥已引起了各類生產(chǎn)者、研究機構(gòu)和普通消費者廣泛的關(guān)注。我國從1987年開始藜麥的引進種植研究工作，目前藜麥的種植主要集中在山西、甘肅、青海、河北、河南等?。?-5］。目前，國內(nèi)對藜麥的研究主要集中于優(yōu)良品種選育、栽培技術(shù)優(yōu)化等方面，而對藜麥生理功能評價、活性成分分離鑒定、保健食品開發(fā)等方面的研究報道相對較少［4-6］。

大量研究證實，由機體內(nèi)自由基過量產(chǎn)生引發(fā)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、心血管疾病、慢性炎癥等疾病和衰老的重要原因［7-8］。臨床研究證實，適當(dāng)補充外源性抗氧化劑可改善機體內(nèi)的氧化應(yīng)激。膳食中攝入較多的蔬菜、水果、全谷物、豆類等能夠有效地預(yù)防和減緩上述疾病的發(fā)生，這與其富含的多酚類、黃酮類等抗氧化劑密切相關(guān)［9］。本研究以產(chǎn)自山西的白色藜麥為對象，研究了其乙醇提取物的體外自由基清除能力、鐵離子還原能力及對自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化降解的抑制作用，以期為更好地開發(fā)和利用藜麥資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥 山西稼祺農(nóng)業(yè)科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、亞油酸、菲洛嗪（Ferrozine）、牛血清白蛋白（BSA） 合肥博美生物有限公司；2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；β-巰基乙醇、十二烷基磺酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、N，N'-亞甲雙丙烯酰胺、甘氨酸、N，N，N'，N'-四甲基二乙胺（TEMED）、異丙醇、Tris堿、溴酚藍、過硫酸銨 美國Amresco公司；FeSO4·7H2O、冰乙酸、維生素C（VitC） 天津市化學(xué)試劑六廠。

XQ200型多功能高速粉碎機 上海廣沙工貿(mào)有限公司；UV 8100型紫外分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司；DZKW型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Mini-Protean Tetra小型垂直電泳槽、PowerPacTM通用電泳儀電源和ChemiDocTMXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜麥提取物的制備 將藜麥粉碎后過60目篩，即為藜麥粉。準確稱取5.0 g藜麥全粉，加入100 mL 80%的乙醇溶液，混勻后于室溫提取2 h，過濾得上清液，濾渣按上述方法重復(fù)提取一次，合并濾液，于45℃水浴下蒸發(fā)至干，用80%乙醇定容至12.5 mL，得濃度為400 mg/mL的藜麥提取物，于4℃保存?zhèn)溆茫?0］。

1.2.2 DPPH·清除能力的測定 用80%乙醇將藜麥提取物稀釋成系列濃度溶液，待測。參考文獻［11］的方法，取1.0 mL稀釋后的藜麥提取液，加入4.0 mL DPPH·甲醇溶液（100 μmol/L），混合均勻后避光靜置30 min，測定517 nm處的吸光值并計算DPPH·清除率。以樣品濃度為自變量，自由基清除率為因變量作圖并進行線性擬合，計算IC50值。同時，以Trolox梯度溶液（0～160 μmol/L）做標準曲線，樣品的DPPH·清除能力表示為1 g藜麥樣品中所含Trolox當(dāng)量（μmol Trolox當(dāng)量/g）。

1.2.3 ABTS+·清除能力的測定 參考文獻［12］的方法，將15 mL ABTS溶液（7 mmol/L）與264 μL過硫酸鉀溶液（140 mmol/L）混合，在室溫下避光下反應(yīng)16 h后加甲醇進行稀釋，使其在734 nm處的吸光度為0.70±0.02。取1.0 mL稀釋后的藜麥提取液，加入4.0 mL ABTS+·儲備液，充分混勻后室溫避光反應(yīng)30 min，測定734 nm處吸光度并計算清除率。

式中：A0為空白組吸光度，A1為藜麥提取液處理組的吸光度，A0為樣液本底的吸光度。

1.2.4 鐵還原能力（FRAP）測定 參考文獻［13］的方法，分別配制醋酸鈉緩沖液（300 mmol/L，pH3.6）、TPTZ溶液（10 mmol/L）和FeCl3·6H2O溶液（20 mmol/L），將上述3種溶液按10∶1∶1比例混合即得FRAP工作液。取4.0 mL FRAP工作液，加入1.0 mL藜麥提取物溶液，混勻后于37℃避光反應(yīng)30 min，測定593 nm處吸光度。以FeSO4為標準，樣品的FRAP值表示為1 g藜麥達到同樣吸光度所需FeSO4的微摩爾數(shù)表示。

1.2.5 藜麥提取物對Fe2+/VitC誘導(dǎo)亞油酸脂質(zhì)過氧化的影響 參考Kawai等［14］的方法，采用Fe2+/VitC模型誘導(dǎo)亞油酸發(fā)生過氧化反應(yīng)。在終濃度為1 mmol/L的亞油酸溶液中，先加入藜麥提取物溶液（終濃度分別為30、40、50 mg/mL），再加入FeSO4（終濃度為50 μmol/L）和VitC（終濃度為1 mmol/L），混勻后于37℃水浴避光反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，測定硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物（TBARS）含量［15］。

1.2.6 藜麥提取物對AAPH誘導(dǎo)蛋白氧化降解的影響 在BSA終濃度為0.5 mg/mL的反應(yīng)體系中，加入藜麥提取物和終濃度為100 mmol/L的AAPH溶液，于37℃水浴反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，取100 μL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入電泳上樣緩沖液并在100℃加熱煮沸5 min，采用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，用考馬斯藍R-250染色30 min，脫色液脫色，使用Chemi DocTMXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行凝膠成像［16］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗處理重復(fù)3次，實驗結(jié)果均表示為平均值±標準差。采用SPSS for Windows 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，各組間的差異比較采用獨立樣本t檢驗，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥提取物對DPPH·的清除作用

圖1 藜麥提取物對DPPH·的清除作用Fig.1 DPPH·radical scavenging activity of quinoa extract

DPPH·清除實驗是一種簡單、快速、靈敏的抗氧化檢測手段，廣泛應(yīng)用于天然植物提取物體外抗氧化能力檢測。如圖1所示，藜麥提取物能夠有效清除DPPH·，且清除率隨添加濃度的增加而升高，呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。對藜麥提取物濃度（0～50 mg/mL）和DPPH·清除率進行線性擬合，求得藜麥提取物清除DPPH·的IC50值為（43.13±2.41）mg/mL。以Trolox為對照品繪制標準曲線，求得回歸方程為y=0.435x-0.458，R2=0.998，其中y為DPPH·的清除率，x為Trolox溶液濃度（μmol/L）。經(jīng)計算，藜麥提取物清除DPPH· 的Trolox當(dāng)量為（0.81±0.05）mg/g。

2.2 藜麥提取物對ABTS+·的清除作用

由圖2可知，藜麥提取物對ABTS+·具有較強的清除效果，且清除能力隨其添加濃度的升高而越強，呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系（圖2）。對ABTS+·清除率和藜麥提取物濃度（0～40 mg/mL）進行線性擬合，求得藜麥提取物清除ABTS+·的IC50值為（27.91±1.46）mg/mL。

圖2 藜麥提取物對ABTS+·的清除作用Fig.2 ABTS+·radical scavenging capacity of quinoa extract

2.3 藜麥提取物的鐵還原能力（FRAP）

在一般情況下，物質(zhì)的還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)，因此可通過待測物將TPTZ-Fe3+還原成TPTZ-Fe2+的能力來反映其抗氧化能力，結(jié)果常表示為Fe2+當(dāng)量或標準物質(zhì)的抗氧化能力［17］。由圖3可知，在0～40 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著藜麥提取物濃度的增加，反應(yīng)液在593 nm吸光度逐漸升高，即鐵離子還原能力逐漸升高。以FeSO4為標準物質(zhì)繪制標準曲線，求得回歸方程為y=0.002x+0.014，R2=0.997，其中y 為FeSO4標準溶液在593 nm處的吸光度，x為FeSO4標準溶液濃度（μmol/L）。經(jīng)計算，藜麥的FeSO4當(dāng)量為（1.90±0.10）mg/g。

圖3 藜麥提取物的鐵離子還原能力Fig.3 Ferric reducing antioxidant power of quinoa extract

2.4 藜麥提取物對Fe2+/VitC誘導(dǎo)亞油酸氧化的抑制作用

亞油酸是一種含有兩個雙鍵的ω-6脂肪酸，極易發(fā)生氧化。不同濃度藜麥提取物對Fe2+/VitC誘導(dǎo)亞油酸脂質(zhì)過氧化過程中TBARS生成的影響見圖4。

由圖4可知，亞油酸在無Fe2+/VitC條件下氧化反應(yīng)較為緩慢，所形成TBARS含量較低（6.11±1.25）μmol/L；亞油酸與Fe2+/VitC在37℃條件下反應(yīng)24 h后，TBARS含量升高至（27.49±2.08）μmol/L，與空白對照組相比極顯著增加（p＜0.01）。在上述反應(yīng)體系中加入終濃度分別為40 mg/mL和50 mg/mL的藜麥提取物可以顯著抑制亞油酸脂質(zhì)過氧化過程中TBARS的生成（p＜0.01）。

圖4 藜麥提取物對Fe2+/VitC誘導(dǎo)亞油酸氧化的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of quinoa extract on Fe2+/VitC-mediated linoleic acid oxidation

2.5 藜麥提取物對APPH誘導(dǎo)蛋白氧化降解的抑制作用

蛋白質(zhì)是自由基攻擊的重要目標，自由基引發(fā)的蛋白質(zhì)損傷參與了多種疾病的發(fā)生［18］。AAPH是一種偶氮類化合物，在熱分解過程中產(chǎn)量的大量自由基能夠攻擊BSA蛋白，使其多肽鏈發(fā)生斷裂并生成小分子量的肽鏈；經(jīng)考馬斯藍R-250染色后，原始蛋白條帶信號減弱。藜麥提取物對AAPH誘導(dǎo)BSA蛋白氧化降解的影響見圖5。

圖5 藜麥提取物對AAPH誘導(dǎo)BSA蛋白氧化降解的影響Fig.5 Effect of quinoa extract on AAPH-induced BSA oxidative degradation

如圖5所示，與100 mmol/L AAPH在37℃水浴反應(yīng)6 h后，BSA蛋白在自由基作用下發(fā)生氧化降解，造成其蛋白條帶顏色變淺。與AAPH單獨處理組相比，濃度分別為10、50 μg/mL和100 μg/mL的藜麥提取物處理組蛋白條帶顏色逐漸加深，表明藜麥提取物能夠有效抑制AAPH誘導(dǎo)的BSA氧化降解，且抑制作用隨添加濃度的升高而增強。

3 結(jié)論

藜麥乙醇提取物具有良好的體外抗氧化活性，能有效清除DPPH·和ABTS+·，還原能力較強，并能夠有效抑制自由基引發(fā)的亞油酸過氧化和牛血清白蛋白氧化降解；在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，藜麥乙醇提取物的抗氧化能力隨其添加濃度的增加而增強，呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。藜麥作為最適宜人類的全營養(yǎng)食品，應(yīng)當(dāng)進一步分離和鑒定其抗氧化活性成分，確定藜麥抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)；還應(yīng)進一步深入探討藜麥體內(nèi)抗氧化作用及抗氧化機理，從而為藜麥資源的深層次綜合開發(fā)利用提供科學(xué)理論依據(jù)。

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Determination of the in vitro antioxidant capacity of quinoa seeds extracts

XIANG Qi-sen1，2，ZHANG Li-hua1，2，JIANG Ting-ting1，2，ZHANG Wen-jie1，2，LI Yin-li1，2，SHEN Rui-ling1，2，*
（1.College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China；2.Henan Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety，Zhengzhou 450002，China）

The aim of this study was to investigate the in vitro antioxidant activities of extract from quinoa seeds collected from Shanxi using various methods，including DPPH·and ABTS+·scavenging assays and ferric reducing antioxidant power（FRAP）assay.The results showed that the quinoa extract had strong scavenging activities for DPPH·and ABTS+·radicals.The radical scavenging IC50values of quinoa extract were（43.13± 2.41）mg/mL and（27.91±1.46）mg/mL for DPPH·and ABTS+·radicals，respectively.The FRAP value of quinoa was（1.90±0.10）mg FeSO4/g.The quinoa extract also significantly inhibited free radical-induced peroxidation of linoleic acid and oxidative degradation of bovine serum albumin.The present study demonstrated the in vitro antioxidant potential of quinoa seeds extracts，providing scientific basis for the estimation of the in vivo antioxidant activities of quinoa seeds.

quinoa seeds；antioxidant capacity；free radical scavenging capacity；ferric reducing antioxidant power

TS202.1

A

1002-0306（2016）02-0078-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.007

2015－06－12

相啟森（1984-），博士，講師，研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng)，E-mail：xiangqisen2006@163.com。

*通訊作者：申瑞玲（1967-），博士，教授，研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng)，E-mail：shenrl1967@163.com。

河南省高等學(xué)校重點科研項目（15A550024）；鄭州輕工業(yè)學(xué)院博士科研基金資助項目（2013BSJJ079）。